リン酸化によってアクチンとの結合が制御されるタンパク質の分離同定

与肌动蛋白结合受磷酸化调节的蛋白质的分离和鉴定

• 批准号: 09760264
• 负责人: 中村 文彦
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760264/
• 关键词: リン酸化; 細胞骨格; アクチン

平成9年度、ヨウ素125で標識したアクチンプローブを用いて、ニトロセルロース膜上に複数のバンドが検出されたが、そのうちの一つはリン酸化モエシンと同定された。すなわち、モエシンとアクチンフィラメントの結合が、モエシンのリン酸化によって制御されていることを示唆する結果が得られた。続いて、リン酸化モエシンとアクチンフィラメントの結合が、溶液中でも検出できるかどうかを調べるために、アクチンフィラメントとの共沈法を試みた。しかし、共沈実験の結果、従来の方法ではモエシンが凝集して非特異的に沈降してしまうため、あたかもアクチンと共沈したかに見えることが明かとなった。凝集を阻害するために、非イオン系界面活性剤であるTriotn X-100を反応系に加えると、モエシンは可溶化されたが、アクチンとの結合は検出されなかった。ところが、陽イオン系の界面活性剤を添加するとモエシンは可溶性となるが、リン酸化モエシンのみアクチンフィラメントと共沈することが明らかとなった。このことはモエシンを活性するためにはリン酸化のみでは不十分で、別の因子が必要なことを示唆している。そこでこの因子を明らかにするために、種々の生体成分を調べた結果、ホスファチジルイノシトールポリリン酸が関与していることが明かになった。

1997 年，使用碘 125 标记的肌动蛋白探针在硝酸纤维素膜上检测到多个条带，其中一条被鉴定为磷酸化 moesin。换句话说，结果表明模蛋白和肌动蛋白丝之间的结合受到模蛋白磷酸化的调节。接下来，为了研究磷酸化模蛋白和肌动蛋白丝之间的结合是否可以在溶液中检测到，我们尝试了肌动蛋白丝的共沉淀方法。然而，共沉淀实验的结果表明，用常规方法，莫斯蛋白非特异性地聚集和沉淀，使其看起来好像与肌动蛋白共沉淀。当将非离子表面活性剂 Triotn X-100 添加到反应体系中以抑制聚集时，moesin 被溶解，但没有检测到与肌动蛋白的结合。然而，当添加阳离子表面活性剂时，模蛋白变得可溶，但很明显只有磷酸化的模蛋白与肌动蛋白丝共沉淀。这表明单独的磷酸化不足以激活moesin，还需要另一个因素。为了澄清这个因素，我们研究了各种生物成分，发现磷脂酰肌醇多磷酸参与其中。

项目成果

Fumihiko Nakamura et al.: "Phosphorylation of Threonine558 and Polyphosphoinositides are Both Involved in the Regulation of F-Actin Binding of Platelet Moesin:A Multi-step Model of Activation" Molecular Biology of the Cell. (印刷中).

Fumihiko Nakamura 等人：“苏氨酸 558 的磷酸化和多磷酸肌醇都参与调节血小板肌动蛋白的 F-肌动蛋白结合：激活的多步模型”《细胞分子生物学》（正在出版）。