細胞の増殖・分化における3′-リン酸化イノシトールリン脂質の役割

3-磷酸化肌醇磷脂在细胞增殖和分化中的作用

基本信息

批准号：
09760072
负责人：
永田諭志
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760072/
关键词：
3′-リン酸化イノシトールリン脂質 PIP_3 ホスファチジルイノシトール3-キナーゼモノクローナル抗体競合法ELISA 細胞内局在細胞分化細胞増殖ホファチジルイノシトールモノクロナール抗体細胞内情法伝達

项目摘要

3'-リン酸化イノシ卜ールリン脂質は、細胞を増殖・分化因子刺激した際に活性化されるホスファチジルイノシトール3-キナーゼによって生産され、核への刺激伝達、細胞骨格の再構築、細胞内小胞輸送など多面的に働く2次メッセンジャーであると考えられている。本研究では細胞応答における3'-リン酸化イノシトールリン脂質の役割を明らかにするために、ホスファチジルイノシチド-3,4,5-3リン酸(PIP_3)に特異的なモノクローナル抗体の作製を行った。その結果PIP_3に特異的なモノクローナル抗体を各4クローン得た。このうち、#11と名づけた抗体が、最も高い反応性を示し、各種リン脂質を用いたリポソームリシスアッセイ、ELISA、PIP3アナログを用いた沈降反応などの解析から、PIP3のリン酸化イノシトール環を主に認識し、グリセロール骨格の一部もエピトープ構造に含むと考えられた。この抗体のサブクラスはIgG3であり、各種アッセイにおいて比較的高い非特異反応性を示したため、非特異反応性が低い抗体の取得を目的として、#11抗体のIgGlクラススイッチ変異体の取得を行ったとごろ、非特異反応の減弱した同一特異性のクローンを得ることができた。この#11-IgGlを用いて、PIP3測定のための、競合法ELISAを構築したところ、検出感度20nMのELISAを開発することができた。本方法は今まで、測定が困難であったPIP3量の測定に広く応用され得るものと考えており、細胞内でのPIP3動態の解析に役立つと考えられる。一方、得られた#11抗体の可変領域をクローニングすることにも成功しており、今後組み換え抗体の細胞内に発現による、種々細胞機能抑制や、組み換え抗体とGFPとの融合蛋白の細胞内発現による、PIP3の細胞内局在の可視化などにより、PIP3の働きを明らかにしていく予定である。

3'-磷酸化的肌醇磷脂是由磷脂酰肌醇3-激酶产生的，当细胞受到增殖和分化因子刺激时，该磷脂酶3-激酶会被激活，并被认为是以多种方式运行的次级使者，包括对细胞核，细胞骨架，胞骨骨骼再生结构和静脉内的螺旋螺旋式和静脉息护物。在这项研究中，为了阐明3'-磷酸化的肌醇磷脂在细胞反应中的作用，我们制备了一种针对磷脂酰固醇-3,4,5-3-磷酸盐（PIP_3）的单克隆抗体。结果，获得了针对PIP_3的每种单克隆抗体的四个克隆。其中，名为＃11的抗体表现出最高的反应性，并且通过使用PIP3类似物的各种磷脂，ELISA，ELISA和降水反应等分析，据认为，PIP3的磷酸化肌醇环主要识别出孔贝克罗果Backbone Backbone Backbone的一部分。该抗体是IgG3的子类，在各种测定中表现出相对较高的非特异性反应性，并且获得＃11抗体的IgGL类开关突变体，目的是获得低非特异性反应性的抗体，具有相同特异性的克隆，具有相同的非特异性反应的克隆，获得了相同的特异性。使用此＃11-IGGL，我们为PIP3测量构建了一个竞争性ELISA，并且能够开发具有20 nm的检测灵敏度的ELISA。我们认为，该方法可以广泛应用于PIP3量的测量，到目前为止很难测量，并且认为这对于分析细胞内的PIP3动力学是有用的。另一方面，我们还成功克隆了＃11抗体的可变区域，我们计划通过通过在细胞中的重组抗体表达表达重组抗体来抑制各种细胞功能来阐明PIP3的功能，并通过在重组抗体之间的融合蛋白和GFP之间的融合蛋白内表达PIP3的亚细胞定位。