モルヒネ活性代謝物生成に関わるグルクロン酸転移酵素の臓器分布について

关于参与吗啡活性代谢物产生的葡萄糖醛酸基转移酶的器官分布

基本信息

批准号：
08771203
负责人：
石井祐次
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

当教室でクローニングしているモルヒネの活性代謝物生成に関するモルモット肝UGT55KのcDNAにおいて基質特異性の決定に重要な領域を、二価金属に特異的に結合するpoly-Histidineとのfusion proteinとして大腸菌に発現させるため、読み枠を合わせてpTrcHis vectorにサブクローニングした。このようにして構築した組換えプラスミド(pGUGT-M6N)でE.coli Yop10を形質転換させた。これを、大量培養して可溶化し、fusion proteinをNi^<2+>を固定化させたアフィニティーカラムを用いて精製した。精製fusion proteinを、フロイト完全アジュバンドとのemulsionとしてウサギに感作し、数回の追加免疫の後、採血し抗血清を調製した。この抗体は、部分精製のHartley系雄性モルモットのUGT55Kを認識したが、その特異性は必ずしも高くはなかった。これは抗原とした組換えペプチドが変性状態のものであったためであると思われる。Immunoblottingによる解析については更なる検討を行っているところである。また、肝臓と脳のmRNAを調製し、このUGT55Kは特異的なRT-PCRを行ったところ、肝臓だけでなく脳においても特異的な産物が得られ、その塩基配列から、脳内にUGT55Kの存在が示唆された。このことは、脳におけるM6Gの生成の可能性と脳機能へのUGTの関与を考える上で非常に興味深いものである。

我们实验室克隆的豚鼠肝脏 UGT55K 的 cDNA 涉及吗啡活性代谢物的产生，其中对确定底物特异性重要的区域被转移到大肠杆菌中，作为与聚组氨酸的融合蛋白，它特异性结合二价金属，为了表达，它被亚克隆到具有匹配阅读框的 pTrcHis 载体中。用如此构建的重组质粒(pGUGT-M6N)转化大肠杆菌Yop10。将其大量培养并溶解，并使用固定有Ni 2+ 的亲和柱纯化融合蛋白。将纯化的融合蛋白与弗洛伊德完全佐剂制成乳剂致敏家兔，经过数次加强后，采血并制备抗血清。该抗体识别部分纯化的Hartley雄性豚鼠UGT55K，但其特异性不一定高。这似乎是因为用作抗原的重组肽处于变性状态。我们目前正在使用免疫印迹法进行进一步的分析研究。此外，我们还制备了肝脏和脑部的mRNA，并针对该UGT55K进行了特异性RT-PCR，不仅在肝脏中而且在脑部中都获得了特异性产物，并且从碱基序列发现UGT55K存在于大脑的存在被提出。考虑到大脑中 M6G 生成的可能性以及 UGT 参与大脑功能的可能性，这是非常有趣的。