アルツハイマー病脳のアミロイドβ蛋白生成酵素の同定に関する分子生物学的研究

阿尔茨海默病脑中β-淀粉样蛋白产生酶鉴定的分子生物学研究

基本信息

批准号：
08770781
负责人：
続佳代
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

クロロキンミオパチーはアルツハイマー病のアミロイド病変のモデルと考えられる。この筋病変を用いた本研究によって以下のことを明らかにした。1.この筋病変の経時的変化を抗Aβ抗体を用いた免疫染色で観察すると、クロロキン投与14日目より空胞内や空胞周囲が染色された。投与14日目の切片にAβ40、Aβ42を認識する断端特異抗体(BC40、BC42)を用いて染色すると、抗Aβ抗体で染色されるほぼ半数がBC42で、また一部がBC40でも染色された。この筋病変ではAβ42が優位であり、Aβ40、Aβ42のN端ならびにC端を切断するβ、γ-セクレターゼが実際に存在していることを明らかにした。2.この病変筋にAβが存在するか否かを生化学的に検討した。病変ヒラメ筋を各種プロテアーゼインヒビター添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、蛋白を可溶化した。Tris-tricine電気泳動後PVDFメンブランに転写し、抗Aβ抗体にて免疫反応を行った。投与14日目より、抗Aβ抗体と反応する3、および4kDaの明瞭なバンドが検出された。この3および4kDaの断片は、p3ならびにAβに相当すると考えられる。現在sequencingを試みている。3.セクレターゼを同定するために、病変ヒラメ筋をEDTA添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心法により抽出液(粗酵素液)を得た。この粗酵素液に組み換え大腸菌より精製したアミロイド前駆体蛋白(APP)を加え、APPの処理過程を経時的に観察した。粗酵素液を作用させたAPPには未処理APPにはみられない幾つかのAβに関連する断片がみられた。このバンドをdirect microsequencing法にてアミノ酸配列の決定を試みている。また、基質として大腸菌由来のAPPより純度の高いAβのN端、およびC端を含む合成ペプチドを用いて同様の検討を行いセクレターゼの同定を試みている。

氯喹肌病被认为是阿尔茨海默病淀粉样蛋白病变的模型。这项利用这种肌肉损伤的研究揭示了以下内容。 1.当通过使用抗Aβ抗体的免疫染色观察该肌肉病变的时间变化时，从给予氯喹后第14天开始对内部和周围的空泡进行染色。当给药第14天的切片用识别Aβ40和Aβ42的残端特异性抗体（BC40、BC42）染色时，抗Aβ抗体染色的切片中几乎一半被BC42染色，有些还被BC40染色。。我们发现，Aβ42 在这种肌肉病变中占主导地位，并且实际上存在切割 Aβ40 和 Aβ42 N 末端和 C 末端的 β 和 γ 分泌酶。 2.我们通过生化研究了这种患病肌肉中是否存在Aβ。将患病的比目鱼肌在含有各种蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中均质化，以溶解蛋白质。 Tris-tricine 电泳后，将其转移到 PVDF 膜上并与抗 Aβ 抗体进行免疫反应。从给药第 14 天起，检测到与抗 Aβ 抗体反应的 3 kDa 和 4 kDa 的清晰条带。 3 和 4 kDa 片段被认为对应于 p3 和 Aβ。目前正在尝试测序。 3.为了鉴定分泌酶，将受损的比目鱼肌在添加EDTA的磷酸盐缓冲液中匀浆，并通过离心获得提取物（粗酶溶液）。将从重组大肠杆菌纯化的淀粉样前体蛋白（APP）添加到该粗酶溶液中，并观察APP随时间的加工过程。在用粗酶溶液处理的APP中发现了一些未处理的APP中未发现的Aβ相关片段。我们正在尝试使用直接微测序来确定该条带的氨基酸序列。此外，我们正在尝试通过使用含有 Aβ N 末端和 C 末端的合成肽（其比大肠杆菌衍生的 APP 更纯化）作为底物进行类似的研究来鉴定分泌酶。