アルツハイマー病脳のアミロイドβ蛋白生成酵素の同定に関する分子生物学的研究

阿尔茨海默病脑中β-淀粉样蛋白产生酶鉴定的分子生物学研究

基本信息

批准号：
08770781
负责人：
続佳代
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

クロロキンミオパチーはアルツハイマー病のアミロイド病変のモデルと考えられる。この筋病変を用いた本研究によって以下のことを明らかにした。1.この筋病変の経時的変化を抗Aβ抗体を用いた免疫染色で観察すると、クロロキン投与14日目より空胞内や空胞周囲が染色された。投与14日目の切片にAβ40、Aβ42を認識する断端特異抗体(BC40、BC42)を用いて染色すると、抗Aβ抗体で染色されるほぼ半数がBC42で、また一部がBC40でも染色された。この筋病変ではAβ42が優位であり、Aβ40、Aβ42のN端ならびにC端を切断するβ、γ-セクレターゼが実際に存在していることを明らかにした。2.この病変筋にAβが存在するか否かを生化学的に検討した。病変ヒラメ筋を各種プロテアーゼインヒビター添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、蛋白を可溶化した。Tris-tricine電気泳動後PVDFメンブランに転写し、抗Aβ抗体にて免疫反応を行った。投与14日目より、抗Aβ抗体と反応する3、および4kDaの明瞭なバンドが検出された。この3および4kDaの断片は、p3ならびにAβに相当すると考えられる。現在sequencingを試みている。3.セクレターゼを同定するために、病変ヒラメ筋をEDTA添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心法により抽出液(粗酵素液)を得た。この粗酵素液に組み換え大腸菌より精製したアミロイド前駆体蛋白(APP)を加え、APPの処理過程を経時的に観察した。粗酵素液を作用させたAPPには未処理APPにはみられない幾つかのAβに関連する断片がみられた。このバンドをdirect microsequencing法にてアミノ酸配列の決定を試みている。また、基質として大腸菌由来のAPPより純度の高いAβのN端、およびC端を含む合成ペプチドを用いて同様の検討を行いセクレターゼの同定を試みている。

氯喹肌病被认为是阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白病变的模型。这项使用该肌肉病变的研究揭示了以下内容：1。当使用抗Aβ抗体进行免疫染色时观察到这种肌肉病变的变化时，从氯喹的14天开始对液泡进行免疫染色时，内部和周围的液泡周围被染色。当识别Aβ40和Aβ42的树桩特异性抗体（BC40，BC42）染色时，将几乎一半用抗Aβ抗体染色的抗体被BC42染色，其中一些用BC40染色。据显示，Aβ42在这种肌肉病变中占主导地位，并且确实存在β，γ-分泌酶裂解Aβ40和Aβ42的N-和C端。 2。我们生化研究了该病变肌肉中是否存在Aβ。将比目鱼肌肉在具有各种蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中匀浆，以溶解蛋白质。在三环电泳后，将细胞转移到PVDF膜上，并用抗Aβ抗体进行免疫反应。在给药的第14天，检测到3和4 kDa的不同带与抗Aβ抗体反应。这个3和4 kDa片段被认为对应于P3和Aβ。我目前正在尝试进行排序。 3。为了识别泌尿酶，用EDTA在磷酸盐缓冲液中匀浆，并通过离心萃取（粗酶溶液）在磷酸盐缓冲液中匀浆。向这种粗酶溶液加入从重组大肠杆菌中纯化的淀粉样蛋白前体蛋白（APP），并且随着时间的推移观察到APP处理过程。在未经处理的应用中未发现的应用中发现了几个与Aβ相关的片段。该带的氨基酸序列是通过直接微钉试验的。此外，已经进行了类似的研究，以使用含有Aβ的N和C末端的合成肽来识别分泌酶，这些肽比源自大肠杆菌的应用更纯净。