組み換え型ヘルペスウィルスを用いた遺伝子治療の基礎的研究

重组疱疹病毒基因治疗的基础研究

• 批准号: 08770219
• 负责人: 服部 聡
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770219/
• 关键词: ヘルペスウイルス; ウィルスベクター; HPC-1; 遺伝子治療

研究代表者はこれまでヒトを含め、広い宿主領域を持ち、神経親和性が高く、動物個体脳に直接注入して感染・発現できる非増殖性の欠損型ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus type 1, HSV)ベクター系(Mol.Cell.Neurosci.2: 320, 1991)を用いて神経科学研究および遺伝子治療研究に応用すべく、基礎データを集積しつつあり、(1995年ワークショップ「神経発達研究におけるあたらしいアプローチ」にて発表;シュプリンガー社「神経生物学のための遺伝子導入発現研究法」(1997))、また、グルタミン酸受容体、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-2、癌抑制遺伝子VHL等の各cDNAクローンのHSVベクター系の構築、細胞・個体への感染発現実験について、既に経験を積み、実績を挙げつつある(Biochem.Soc.Trans.1996; "Gene Therapy"(Cold Spring Harbor Laboratory)1996)。1)LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として組み込んだコントロールウイルスペクターを用いて、PC12細胞、ラット胎仔大脳皮膚初代培養細胞において、X-Gal histochemistryからその感染効率がほぼ100%であることを確認している。2)これまで、マウスグルタミン酸受容体α1、ζ1、ε2、IFN-γ、IL-2、VHL、HPC-1アンチセンス組換型HSVウイルスを作製している。得られたウイルスについてPCR、ドットブロットで確認し、次にこれを感染させた種々の細胞においてmRNA、タンパク質が発現していることを各々、RT-PCR、ウェスタン解析で確認した。さらに電気生理学、生化薬理学的、検討等を行い、これらの分子的、機能的解析を進めている。3)ヌードマウスを用いた腫瘍モデルにおいIFN-γ、IL-2組換型 HSVウイルスを接種したところ、腫瘍抑制効果を確認した。さらに詳細な検討を進めている。4)発現実験の最適化を行っている。本発現系は、高濃度、長時間の培養条件では細胞への影響が大きい。PC12細胞における、本系を用いた発現は、非常に速やかで感染後約2時間で目的蛋白を確認でき、細胞への影響もほとんど見られない。さらに長時間感染においても、培地にacyclovirを1μg/ml添加することによって細胞への影響を減弱しうることを確かめている。5)組換えHSVウイルス感染細胞の同定には、免疫組織染色が一般的である。しかし、これらの方法は頻雑であり、適当な抗体が存在しない場合行えない。そこで、amplicon plasmid内の発現ユニットの下流にCITE(CAP independent Translation Enhancer)配列とlacZ遺伝子を付加した。現在、α1サブユニット等について新たな構築を進めている。これにより、目的遺伝子のmRNAに融合した形でCITE-lacZ mRNAが合成され、目的遺伝子だけでなくCITE配列を持つmRNAも同時に蛋白質に翻訳される。lacZ産物であるβ-galactosidaseの発色反応は既に確立されているので、これを利用し感染細胞を同定できる。こうした新規のHSVベクターを順次開発している。

The researcher previously had a wide host region, including humans, and has a high neuroaffinity, non-proliferative, deficient herpesvirus (HSV) vector system (Mol.Cell.Neurosci.2: 320, Basic data is being accumulated to apply it to neuroscience and gene therapy research using 1991) (Published at the workshop "New Approach in Neurodevelopmental Research"; Springer's "Gene Introduction Expression Research Method （1997年）），并且已经获得了经验并在构建诸如谷氨酸受体，干扰素（IFN） - γ，interleukin（IL）-2和癌症抑制器vhl的HSV载体系统（例如谷氨酸受体，干扰素（IFN） - γ（IFN） - γ，IL）和抑制基因的癌症基因的实验的cDNA载体系统方面以及对细胞和癌症抑制癌症的实验（Beioperions）（Beioperains）（Bene thern.19）（冷疗法）（冷疗法）（冷疗法）（冷疗法， Spring Harbour实验室）1996）。 1）X-GAL组织化学使用对照病毒进行了LACZ基因作为报告基因的整合，证实了PC12细胞和原发性培养的大鼠胎儿胎儿皮肤细胞的感染效率几乎为100％。 2）迄今为止，已经产生了小鼠谷氨酸受体α1，ζ1，ε2，IFN-γ，IL-2，VHL和HPC-1反义重组HSV病毒。通过PCR和DOT印迹证实了所获得的病毒，然后，RT-PCR和Western Analysis证实了MRNA和蛋白质分别在被该病毒感染的各种细胞中表达。此外，正在进行电生理学，生物制药和研究，并正在进行分子和功能分析。 3）使用裸小鼠在肿瘤模型中接种IFN-γ和IL-2重组HSV病毒，证实肿瘤抑制作用。正在进行进一步的详细考虑。 4）优化表达实验。该表达系统对高浓度和长期培养条件下的细胞具有很大的影响。在PC12细胞中使用该系统的表达很快得到证实，并且可以在感染后大约2小时证实靶蛋白，对观察到的细胞几乎没有影响。此外，已经证实，即使在长期感染中，在培养基中添加1μg/ml的acyclovir也可以减少对细胞的影响。 5）免疫组织学对于鉴定重组HSV病毒感染细胞是常见的。但是，这些方法很复杂，在没有合适抗体的情况下无法进行。因此，在扩增子质粒内的表达单元的下游添加了引用（CAP独立翻译增强子）序列和LACZ基因。我们目前正在研究α1亚基的新结构等。这将融合到靶基因mRNA的形式的形式合成了cite-lacz mRNA，不仅靶基因，而且具有cite序列的mRNA的mRNA同时被转化为蛋白质。由于已经建立了β-半乳糖苷酶的发色反应，因此可以使用它鉴定受感染的细胞。这些新的HSV矢量正在一个接一个地开发。

项目成果

Kawamoto, S.: "Ariginine-481 mutation abolishes ligand-binding of the AMPA-selective glutamate receptor channel α1 subunit." Mol.Brain Res.(in press). (1997)

Kawamoto, S.：“Arginine-481 突变消除了 AMPA 选择性谷氨酸受体通道 α1 亚基的配体结合。”（Mol.Brain Res）（1997 年出版）。

服部,聡: "欠損型ヘルペスウイルスペクター系を用いたグルタミン酸受容体チャネルの発現・解析" 生化学. 68・7. 866 (1996)

Hattori，Satoshi：“使用有缺陷的疱疹病毒胸膜系统的谷氨酸受体通道的表达和分析”生物化学68・7（1996）。