組み換え型ヘルペスウィルスを用いた遺伝子治療の基礎的研究

重组疱疹病毒基因治疗的基础研究

• 批准号: 08770219
• 负责人: 服部 聡
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770219/
• 关键词: ヘルペスウイルス; ウィルスベクター; HPC-1; 遺伝子治療

研究代表者はこれまでヒトを含め、広い宿主領域を持ち、神経親和性が高く、動物個体脳に直接注入して感染・発現できる非増殖性の欠損型ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus type 1, HSV)ベクター系(Mol.Cell.Neurosci.2: 320, 1991)を用いて神経科学研究および遺伝子治療研究に応用すべく、基礎データを集積しつつあり、(1995年ワークショップ「神経発達研究におけるあたらしいアプローチ」にて発表;シュプリンガー社「神経生物学のための遺伝子導入発現研究法」(1997))、また、グルタミン酸受容体、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-2、癌抑制遺伝子VHL等の各cDNAクローンのHSVベクター系の構築、細胞・個体への感染発現実験について、既に経験を積み、実績を挙げつつある(Biochem.Soc.Trans.1996; "Gene Therapy"(Cold Spring Harbor Laboratory)1996)。1)LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として組み込んだコントロールウイルスペクターを用いて、PC12細胞、ラット胎仔大脳皮膚初代培養細胞において、X-Gal histochemistryからその感染効率がほぼ100%であることを確認している。2)これまで、マウスグルタミン酸受容体α1、ζ1、ε2、IFN-γ、IL-2、VHL、HPC-1アンチセンス組換型HSVウイルスを作製している。得られたウイルスについてPCR、ドットブロットで確認し、次にこれを感染させた種々の細胞においてmRNA、タンパク質が発現していることを各々、RT-PCR、ウェスタン解析で確認した。さらに電気生理学、生化薬理学的、検討等を行い、これらの分子的、機能的解析を進めている。3)ヌードマウスを用いた腫瘍モデルにおいIFN-γ、IL-2組換型 HSVウイルスを接種したところ、腫瘍抑制効果を確認した。さらに詳細な検討を進めている。4)発現実験の最適化を行っている。本発現系は、高濃度、長時間の培養条件では細胞への影響が大きい。PC12細胞における、本系を用いた発現は、非常に速やかで感染後約2時間で目的蛋白を確認でき、細胞への影響もほとんど見られない。さらに長時間感染においても、培地にacyclovirを1μg/ml添加することによって細胞への影響を減弱しうることを確かめている。5)組換えHSVウイルス感染細胞の同定には、免疫組織染色が一般的である。しかし、これらの方法は頻雑であり、適当な抗体が存在しない場合行えない。そこで、amplicon plasmid内の発現ユニットの下流にCITE(CAP independent Translation Enhancer)配列とlacZ遺伝子を付加した。現在、α1サブユニット等について新たな構築を進めている。これにより、目的遺伝子のmRNAに融合した形でCITE-lacZ mRNAが合成され、目的遺伝子だけでなくCITE配列を持つmRNAも同時に蛋白質に翻訳される。lacZ産物であるβ-galactosidaseの発色反応は既に確立されているので、これを利用し感染細胞を同定できる。こうした新規のHSVベクターを順次開発している。

课题组主要研究人员一直在研究一种非复制缺陷型疱疹病毒（Herpes Simplex Virus type 1，HSV），其宿主范围广泛，包括人类，具有较高的向神经性，可以直接注射到动物大脑中感染并表达病毒）载体系统（Mol.Cell.Neurosci.2：320，正在积累基础数据，以便将其应用于神经科学研究和基因治疗研究（使用（1997））和谷氨酸我们已经积累了构建HSV载体系统的经验，包括伴侣受体、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-2、抑癌基因VHL等的cDNA克隆，以及在细胞和个体中进行表达感染的实验。 ，正在取得成果（Biochem.Soc.Trans.1996； “基因疗法”（冷泉港实验室）1996）。 1) 使用包含 LacZ 基因作为报告基因的对照病毒载体，我们使用 X-Gal 组织化学证实 PC12 细胞和原代培养的大鼠胎儿脑皮肤细胞的感染效率几乎为 100%。 2）到目前为止，我们已经产生了与小鼠谷氨酸受体α1、δ1、ε2、IFN-γ、IL-2、VHL和HPC-1反义的重组HSV病毒。获得的病毒经PCR和斑点印迹证实，然后分别通过RT-PCR和Western分析证实感染该病毒的各种细胞中mRNA和蛋白的表达。此外，我们正在进行电生理学、生物药理学等，并正在进行这些的分子和功能分析。 3)当用IFN-γ和IL-2重组HSV病毒接种裸鼠肿瘤模型时，证实了肿瘤抑制作用。更详细的研究正在进行中。 4）我们正在优化表达实验。该表达系统对高浓度、长期培养条件下的细胞有很大的影响。使用该系统在PC12细胞中的表达速度极快，感染后约2小时即可确认目标蛋白，对细胞几乎没有影响。此外，我们已经证实，即使在长期感染期间，通过在培养基中添加1μg/ml的阿昔洛韦也可以减弱对细胞的影响。 5) 免疫组织化学染色常用于鉴定重组HSV病毒感染的细胞。然而，这些方法很麻烦，并且在没有适当抗体的情况下无法进行。因此，我们在扩增子质粒中的表达单元下游添加了CITE（CAP独立翻译增强子）序列和lacZ基因。目前，我们正在进行α1亚基等的新构建。结果，CITE-lacZ mRNA以与靶基因的mRNA融合的形式合成，并且不仅靶基因而且含有CITE序列的mRNA同时被翻译成蛋白质。由于 lacZ 产物 β-半乳糖苷酶的显色反应已经建立，因此可用于识别感染细胞。我们正在陆续开发这些新的HSV载体。

项目成果

Kawamoto, S.: "Ariginine-481 mutation abolishes ligand-binding of the AMPA-selective glutamate receptor channel α1 subunit." Mol.Brain Res.(in press). (1997)

Kawamoto, S.：“Arginine-481 突变消除了 AMPA 选择性谷氨酸受体通道 α1 亚基的配体结合。”（Mol.Brain Res）（1997 年出版）。

服部,聡: "欠損型ヘルペスウイルスペクター系を用いたグルタミン酸受容体チャネルの発現・解析" 生化学. 68・7. 866 (1996)

Hattori，Satoshi：“使用有缺陷的疱疹病毒胸膜系统的谷氨酸受体通道的表达和分析”生物化学68・7（1996）。