タンパク質翻訳後修飾解析のための部位特異的モノクローナル抗体の作製

生成用于蛋白质翻译后修饰分析的位点特异性单克隆抗体

基本信息

批准号：
22930027
负责人：
成相裕子
金额：
$ 0.36万
依托单位：
Shimane University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22930027/
关键词：
モノクローナル抗体 SUMO化翻訳後修飾

项目摘要

研究目的タンパク質には、リン酸化、糖鎖付加、脂質付加、メチル化、アセチル化などばかりではなく、ユビキチンやSUMO (Small Ubiquitin-related Modifier)のようなポリペプチド付加による翻訳後修飾も存在し、タンパク質分解、DNA修復、シグナル伝達などの生命現象にかかわることが明らかになってきている。本研究では、ポリペプチドによるタンパク質翻訳後修飾を認識するマウスモノクローナル抗体の作製を目的とした。研究方法斉藤らが開発した大腸菌内SUMO化発現システムを用いて抗原を精製後、マウスに免疫し、常法により細胞融合を行った。HAT選択培地により選択培養後、培養上清を用いてSUMO-1、標的タンパク質およびSUMO-1化された標的タンパク質の3種類のELISA法により初期スクリーニングを行った。その後、イムノブロット法、免疫沈降法により、特異的なハイブリドーマの選別を行い、さらに限界希釈法によりクローン化した。研究成果SUMO化部位を同定した色素性乾皮症の原因遺伝子であるXPC (xeroderma pigmentosum group C-complementing protein)タンパク質を標的タンパク質として、SUMO化XPCのみを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを2株得た。SUMO化タンパク質の部位特異的SUMO化状態を認識できるマウスモノクローナル抗体の作製は、SUMO化タンパク質の機能解析のため熱望されている。今回作製したSUMO化状態を認識できるマウスモノクローナル抗体は、ポリペプチドによるタンパク質翻訳後修飾に関する部位特異的翻訳後修飾の機能解析ツールとして使用可能である。今後さらなる検討が必要である。

研究目标蛋白不仅会发生磷酸化、糖基化、脂质添加、甲基化、乙酰化等，而且还会发生泛素、SUMO（小泛素相关修饰物）等多肽添加等翻译后修饰。参与蛋白质降解、DNA 修复和信号转导等生物现象。在这项研究中，我们的目标是创建一种小鼠单克隆抗体，可以识别多肽对蛋白质的翻译后修饰。研究方法使用Saito等人开发的大肠杆菌SUMO表达系统纯化抗原后，免疫小鼠并使用标准方法进行细胞融合。使用HAT选择培养基进行选择性培养后，使用培养上清液使用三种类型的ELISA方法进行初步筛选：SUMO-1、目标蛋白和SUMO-1修饰的目标蛋白。此后，通过免疫印迹和免疫沉淀选择特异性杂交瘤，并通过有限稀释进一步克隆。研究结果产生一种单克隆抗体的杂交瘤只特异性识别 SUMO 化的 XPC，该抗体针对的是 XPC（色素性干皮病 C 组互补蛋白）蛋白，该蛋白负责色素性干皮病，其 SUMO 化位点已被确定为 2 份。。迫切需要生产能够识别 SUMO 化蛋白位点特异性 SUMO 化状态的小鼠单克隆抗体，以用于 SUMO 化蛋白的功能分析。我们这次创建的能够识别SUMO化状态的小鼠单克隆抗体可以用作多肽对蛋白质进行位点特异性翻译后修饰的功能分析工具。未来还需要进一步考虑。