小脳プルキンエ細胞樹状突起分岐形成に関与する遺伝子群の単離と機能解析

小脑浦肯野细胞树突分支形成相关基因的分离和功能分析

基本信息

批准号：
09780733
负责人：
古屋茂樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780733/
关键词：
サブトラクション神経細胞 cDNA

项目摘要

本年度は昨年度に引き続きプルキンエ細胞の樹状突起形成期に特異的なcDNAサブトラクトライブラリーの構築とクローンの単離を目指した。また、この研究計画遂行中に非必須アミノ酸であるL-セリンがプルキンエ細胞や海馬錐体細胞の強力な生存促進因子であることを見い出したことから、中枢神経系でL-セリン輸送に関わると推定されるトランスポーター分子をRT-PCR法で単離することを試みた。その結果、これまでにセリン輸送能を持つことが知られているトランスポーターASCT1以外に、脳では発現していないと報告されていたsystem B-like中性アミノ酸トランスポーターの新しいサブタイプを培養小脳神経細胞BNAから初めて単離することに成功し、その構造解析を行なった。(論文投稿準備中)。このcDNAクローンをHEK細胞に導入して安定発現株を得ると、セリンなどの中性アミノ酸輸送活性がベクターのみの対照に比べ4-6倍増加していた。さらに、この分子のユニークな基質特異性としてグリシンの輸送活性を持つことも見い出した。また発達過程での発現パターンをNortern Blottingによって検討すると、出生直後に最も高い発現が観察された。以上の結果から、この新規トランスポーター分子が発達中の中枢神経系において中性アミノ酸輸送を担っているものと予想された。現在この新規トランスポーターとASCT1の脳内での発現分布をin situ hybridizationによって詳細に比較検討中である。また樹状突起形成期特異的クローンの単離と構造解析も平行して継続中である。

今年，继去年之后，我们的目标是构建cDNA消减文库，并分离出浦肯野细胞树突形成阶段特异的克隆。此外，在本研究项目过程中，我们发现L-丝氨酸，一种非必需氨基酸，对浦肯野细胞和海马锥体神经元有很强的促生因子，我们认为它与L-丝氨酸有关。我们尝试使用 RT-PCR 分离假定的转运蛋白分子。结果，除了已知具有转运丝氨酸能力的转运蛋白ASCT1之外，还检测到了一种新的B类中性氨基酸转运蛋白亚型，据报道该亚型在大脑中不表达。我们首次在培养细胞中成功地从脑神经细胞中分离出BNA并分析了其结构。（准备提交论文）。当将此cDNA克隆引入HEK细胞以获得稳定表达菌株时，与仅载体对照相比，丝氨酸等中性氨基酸的转运活性增加了4-6倍。此外，我们发现该分子具有甘氨酸转运活性作为独特的底物特异性。此外，当通过Nortern blotting检查发育过程中的表达模式时，在出生后立即观察到最高表达。基于上述结果，预测这种新的转运蛋白分子负责在发育中的中枢神经系统中转运中性氨基酸。我们目前正在通过原位杂交对这种新转运蛋白和ASCT1在大脑中的表达分布进行详细的比较研究。树突相特异性克隆的分离和结构分析也在进行中。