小脳プルキンエ細胞樹状突起分岐形成に関与する遺伝子群の単離と機能解析

小脑浦肯野细胞树突分支形成相关基因的分离和功能分析

• 批准号: 09780733
• 负责人: 古屋 茂樹
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780733/
• 关键词: サブトラクション; 神経細胞; cDNA; サブトラクション; 神経細胞; cDNA

本年度は昨年度に引き続きプルキンエ細胞の樹状突起形成期に特異的なcDNAサブトラクトライブラリーの構築とクローンの単離を目指した。また、この研究計画遂行中に非必須アミノ酸であるL-セリンがプルキンエ細胞や海馬錐体細胞の強力な生存促進因子であることを見い出したことから、中枢神経系でL-セリン輸送に関わると推定されるトランスポーター分子をRT-PCR法で単離することを試みた。その結果、これまでにセリン輸送能を持つことが知られているトランスポーターASCT1以外に、脳では発現していないと報告されていたsystem B-like中性アミノ酸トランスポーターの新しいサブタイプを培養小脳神経細胞BNAから初めて単離することに成功し、その構造解析を行なった。(論文投稿準備中)。このcDNAクローンをHEK細胞に導入して安定発現株を得ると、セリンなどの中性アミノ酸輸送活性がベクターのみの対照に比べ4-6倍増加していた。さらに、この分子のユニークな基質特異性としてグリシンの輸送活性を持つことも見い出した。また発達過程での発現パターンをNortern Blottingによって検討すると、出生直後に最も高い発現が観察された。以上の結果から、この新規トランスポーター分子が発達中の中枢神経系において中性アミノ酸輸送を担っているものと予想された。現在この新規トランスポーターとASCT1の脳内での発現分布をin situ hybridizationによって詳細に比較検討中である。また樹状突起形成期特異的クローンの単離と構造解析も平行して継続中である。

今年，与上一个财政年度一样，我们旨在构建一个cDNA，减去特定于Purkinje细胞和分离克隆的树突状形成阶段的文库。此外，在该研究项目的过程中，L-赛氨酸是一种非必需的氨基酸，是Purkinje细胞和海马锥体细胞的强大生存因子，因此，我们试图隔离RT-PCR中的L-Serine Tryment涉及L-Serine在中心神经系统中的转运蛋白分子。结果，我们成功地分离了系统B样中性氨基酸转运蛋白的新型亚型，据报道，该转运蛋白在大脑中未表达，从培养的小脑神经元BNA中，并分析了结构。 （提交纸张正在准备中）。当将该cDNA克隆引入HEK细胞以获得稳定的表达菌株时，与仅使用载体的对照相比，中性氨基酸转运活性（例如丝氨酸）增加了4-6倍。此外，发现甘氨酸转运活性是该分子的独特底物特异性。此外，当使用Nortern印迹检查发育过程中的表达模式时，出生后立即观察到最高的表达。基于上述结果，据预测，这种新型的转运蛋白分子负责发展中心神经系统中的中性氨基酸转运。当前，正在详细比较这种新型转运蛋白和ASCT1表达的大脑分布。同样，对树突形成特异性克隆的隔离和结构分析正在同时进行。