セラミドによる小脳プルキンエ細胞樹状突起形成制御の分子機構

神经酰胺介导调节小脑浦肯野细胞树突形成的分子机制

基本信息

批准号：
08780757
负责人：
古屋茂樹
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は申請者の得たこれまでの知見を踏まえ、新しい機能性脂質分子であるセラミドによる小脳プルキンエ細胞の生存維持と樹状突起形成の調節機構を分子細胞生物学的手法を用いて明らかにすることを目指した。まず生存維持作用について神経栄養因子とセラミドの関連を検討した。NGFやNT-3などのニューロトロフィン(10-100ng/ml)と細胞膜透過性C_6-Ceramide(20μM)はいずれも単独投与では極めて僅かしか培養プルキンエ細胞の生存を促進しなかった(対照の110%程度)。しかしそれらを同時に加えるとプルキンエ細胞の生存数は対照の150%にまで増加した。この増強作用はニューロトロフィンファミリーに特異的であり、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)の場合には観察されなかった。プルキンエ細胞ではニューロトロフィンの低親和性レセプターp75^<NTR>の強い発現は観察されているが、その一方NGFの高親和性レセプターであるTrk Aは発現していない。以上の結果はセラミドがp75^<NTR>の下流で機能している可能性を示唆している。そこで蛍光標識スフィンゴミエリンを基質としHPLCによって高感度に微量の神経細胞からスフィンゴミエリンに由来するセラミドの産生を検出するシステムを開発し、ニューロトロフィンによるスフィンゴミエリナーゼの活性化⇒セラミドの産生の有無を現在検討している。次に樹状突起分岐形成におけるセラミドの役割を検討した。C_6-Ceramide(20μM)の添加はプルキンエ細胞の樹状突起分岐点数を30%増加させた。意外なことにNGFやNT-3などのニューロトロフィンは樹状突起分岐点を増加させなかった。その一方でテトロドトキシン(TTX,5μM)処理によって興奮性膜電位の形成を阻害すると樹状突起の分岐形成は抑制された。しかしC_6-Ceramideを同時に添加すると分岐点数は対照の80%近くまで回復した。これらの結果から樹状突起の分岐形成はシナプス伝達によって調節され、セラミドはその情報伝達に関わる可能性が示唆された。そこで現在プルキンエ細胞と顆粒細胞間のシナプス伝達とセラミド産生の関連を上記のHPLCによる検出システムを用いて検討を行っている。

今年，基于申请人之前的知识，我们将利用分子细胞生物学方法来阐明神经酰胺（一种新的功能性脂质分子）维持小脑浦肯野细胞的存活并调节树突形成的机制。首先，我们研究了神经营养因子和神经酰胺在维持生存作用方面的关系。单独施用时，神经营养因子如 NGF 和 NT-3 (10-100 ng/ml) 以及细胞膜渗透性 C_6-神经酰胺 (20 μM) 在很小程度上促进培养的浦肯野细胞的存活（对照为 110 ng/ml））。％程度）。然而，当同时添加它们时，活浦肯野细胞的数量增加到对照的 150%。这种增强作用是神经营养蛋白家族特有的，而在碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 中未观察到。浦肯野细胞强烈表达p75^<NTR>，一种神经营养素的低亲和力受体，但不表达Trk A，一种NGF的高亲和力受体。这些结果表明神经酰胺可能在 p75^<NTR> 下游发挥作用。因此，我们开发了一种系统，使用荧光标记的鞘磷脂作为底物，使用 HPLC 高灵敏度检测来自微量神经细胞的鞘磷脂来源的神经酰胺的产生，并通过神经营养素激活鞘磷脂酶⇒目前是否产生神经酰胺。正在考虑中。接下来，我们研究了神经酰胺在树突分支形成中的作用。添加 C_6-Ceramide (20 μM) 可使浦肯野细胞中的树突分支点数量增加 30%。令人惊讶的是，NGF 和 NT-3 等神经营养因子并没有增加树突分支。另一方面，当河豚毒素（TTX，5μM）处理抑制兴奋性膜电位的形成时，树突状分支的形成受到抑制。然而，当同时添加C_6-神经酰胺时，支化点数量恢复到对照的近80%。这些结果表明树突分支受突触传递调节，并且神经酰胺可能参与这种信息传递。因此，我们目前正在使用上述 HPLC 检测系统研究浦肯野细胞和颗粒细胞之间的突触传递与神经酰胺产生之间的关系。