骨芽細胞分化と骨形成における線維性異形成症型GNAS変異遺伝子の機能解析

纤维异常增殖型GNAS突变基因在成骨细胞分化和骨形成中的功能分析

基本信息

批准号：
22K17023
负责人：
明石良彦
金额：
$ 3万
依托单位：
Tokyo Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17023/
关键词：
線維性異形成症 GNAS遺伝子ミスセンス変異 GNAS変異遺伝子

项目摘要

本研究の目的は、FDの原因であるGNAS遺伝子のミスセンス変異（R201H)が線維性結合組織の増生と骨芽細胞分化／骨形成を制御するメカニズムをin vitro実験系とin vivo移植実験系を用いて明らかにすることである。そのために、まず骨軟骨前駆細胞への分化能を保持する未分化間葉系細胞株であるC2H10T1/2細胞、骨髄間質細胞由来株であるST2細胞、骨芽細胞葉細胞株であるMC3T3-E1細胞を用いて、FD型変異型GNAS遺伝子の役割をin vitro実験系で明らかにする。FD変異型GNAS遺伝子発現細胞株の樹立のために、R201H変異あるいはR２０１C変異を導入したヒトGNAS遺伝子cDNAをIRES-GFP配列を含むレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングし、パッケージングプラスミドとともに２９３T細胞にトランスフェクションさせた。培養上清を超遠心濃縮して得たレンチウイルス粒子をC2H10T1/2細胞、ST２細胞およびMC3T3-E1細胞の各細胞に感染させた。感染させた細胞は、GFP蛍光を指標としてオールインワン蛍光顕微鏡を用いてFD変異型GNAS遺伝子発現細胞株を樹立させた。コントロール群として、FD変異型GNAS遺伝子が導入されていないempty群およびwild　type群も同様に樹立させた。in vitro実験系において、FD変異型GNAS遺伝子導入群および未導入群のC2H10T1/2細胞、ST２細胞およびMC3T3-E1細胞を得られ、現在、各細胞の細胞増殖能の変化や培養系における骨芽細胞分化の解析を開始し、その検討に着手している。

本研究的目的是通过体外实验系统和体内移植研究导致 FD 的 GNAS 基因错义突变 (R201H) 控制纤维结缔组织增殖和成骨细胞分化/骨形成的机制就是用实验系统来阐明意义。为此，我们首先选择了C2H10T1/2细胞（一种未分化的间充质细胞系，保留分化为骨软骨前体细胞的能力）、ST2细胞（一种骨髓基质细胞来源的细胞系）和MC3T3-细胞（一种成骨细胞系）使用E1细胞，我们将在体外实验系统中阐明FD型突变GNAS基因的作用。为了建立表达FD突变GNAS基因的细胞系，将引入R201H或R201C突变的人GNAS基因cDNA克隆到含有IRES-GFP序列的慢病毒载体质粒中，并与包装质粒I let一起转染到293T细胞中。它发生了。用通过超速离心浓缩培养上清液获得的慢病毒颗粒感染C2H10T1/2细胞、ST2细胞和MC3T3-E1细胞。使用以GFP荧光为指示剂的一体式荧光显微镜，将感染的细胞用于建立表达FD突变GNAS基因的细胞系。作为对照组，还以相同的方式建立空组和未导入FD突变型GNAS基因的野生型组。在体外实验系统中，我们在FD突变GNAS基因导入组和未导入组中获得了C2H10T1/2细胞、ST2细胞和MC3T3-E1细胞，目前正在研究细胞增殖能力的变化我们已经开始分析细胞分化，目前正在研究中。