Development of novel therapeutics against ion transporters expressed in cancer-associated fibroblast

针对癌症相关成纤维细胞中表达的离子转运蛋白的新型疗法的开发

基本信息

批准号：
22K16518
负责人：
清水浩紀
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16518/
关键词：
colon cancer fibroblast ion channel transporter 癌関連線維芽細胞イオン輸送体大腸癌

项目摘要

１，大腸癌切除14症例分の正常組織由来線維芽細胞（以下NF）ならびに癌組織由来線維芽細胞（以下CAF）をセットで分離培養に成功し、上皮系マーカー（EpCAM、サイトケラチン）がNFならびにCAFに存在しないことをタンパクレベルでウェスタンブロッティングを用いて確認した。それぞれのCAFマーカー（αSMA、FAP）のタンパク、RNAレベルをWB、RT-PCRにて確認し、CAF>NFと発現が亢進している細胞ペアを抽出した。さらにそのうち、Boyden chamber法にて上層にヒト大腸癌細胞株HCT116、下層に線維芽細胞を配置し遊走能の解析を行い、CAF>NFと遊走能が亢進している細胞ペアを抽出した。２，１で適格となった3症例分のNF、CAFペアからそれぞれmRNAを抽出してmRNAマイクロアレイ解析を行った。結果から有意にCAF>NFとmRNA発現亢進しているイオンチャネルや膜輸送体を選出した。３，２にて選出した候補をweb上のデータベースや過去の報告などより数個に絞りこみ、２のmRNAマイクロアレイ解析に使用したCAF、NFペアにてマイクロアレイ結果に対するバリデーションをRT-PCR法にて行った。さらにヒト線維芽細胞株を大腸癌細胞株と共培養すること（正常線維芽細胞株のCAF化）により前途のバリデーションを行い、分離培養細胞ペアを用いたマイクロアレイ解析と一致することを確認した。４，標的遺伝子のsiRNAを用い、分離培養したCAFにおいてノックダウンが問題なくできることをRT-PCR法にて確認した。

1、从14例结直肠癌切除病例中成功分离培养出一组正常组织源性成纤维细胞（以下简称NF）和癌组织源性成纤维细胞（以下简称CAF），并进行上皮标志物（EpCAM、细胞角蛋白）检测此外，使用蛋白质印迹法在蛋白质水平上证实了 CAF 中不存在 NF。通过WB和RT-PCR确认每个CAF标记物（αSMA、FAP）的蛋白和RNA水平，并提取表达增加（CAF>NF）的细胞对。此外，采用Boyden小室法，将人结肠癌细胞系HCT116置于上层，成纤维细胞置于下层，分析迁移能力，提取迁移能力增强（CAF>NF）的细胞对。从2.1中三个符合条件的病例的每个NF和CAF对中提取mRNA并进行mRNA微阵列分析。从结果中，我们选择了离子通道和膜转运蛋白，其mRNA表达量随着CAF>NF而显着增加。我们根据在线数据库和过去的报告将3和2中选择的候选者缩小到一些，并使用RT-PCR方法使用2中mRNA微阵列分析中使用的CAF和NF对进行微阵列结果的验证。。通过将人成纤维细胞系与结肠癌细胞系共培养（正常成纤维细胞系的CAF转化）进行进一步验证，并证实结果与使用分离的培养细胞对进行的微阵列分析一致。 4.使用目标基因的siRNA，我们通过RT-PCR证实，在分离培养的CAF中可以毫无问题地实现敲低。