心臓におけるミトコンドリア分解制御機構の解明と心不全治療薬創薬に向けた基礎的検討

阐明心脏中线粒体分解控制机制以及治疗心力衰竭药物开发的基础研究

• 批准号: 22K16102
• 负责人: 村川 智一
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16102/
• 关键词: 心不全; オートファジー; マイトファジー; ミトコンドリアダイナミクス

in vivo実験として、Bcl2-L-13 S272Aノックインマウスを用いて横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷誘導性心不全モデルを作製した。手術後１週、２週、４週で心エコーを行い、４週目で臓器重量のデータを計測するとともに、タンパク質・RNA・組織評価のためのサンプルを採取した。ノックインマウスでは、野生型マウスに比してTACにより左室短縮率の低下及び心重量の増加傾向を認めた。in vitro実験については、Bcl2-L-13 Ser272の責任kinaseを探索するため、siRNAライブラリのスクリーニングを進めている。あらかじめ96 well plateにsiRNA及びtranfection試薬を分注しておき、HA-Bcl2-L-13恒常発現HEK293A細胞を播種することでリバーストランスフェクションを行った。72時間後にCCCPを投与した後、抗p-Bcl2-L-13(Ser272)抗体による蛍光免疫染色を行った。Keyence BZ-X700のウェルスキャン機能を用いて自動撮影を行い、p-Bcl2-L-13(Ser272)陽性シグナルをカウントした。Image Jにより陽性シグナル数を計測し、シグナル数の減少が見られるものを候補として残すこととした。DMSO投与群に対してCCCP投与群で確実にシグナル数の増加が見られたことから、スクリーニングシステムが確立できたと考え、ライブラリスクリーニングを開始している。このライブラリは、708の遺伝子を含んでおり、全解析に39枚の96wellプレートの評価が必要である。現在約半数を超えるプレートにつき撮影を終了している。

对于体内实验，我们使用 Bcl2-L-13 S272A 敲入小鼠，利用横主动脉缩窄 (TAC) 创建了压力过载诱导的心力衰竭模型。术后1周、2周、4周进行超声心动图检查，第4周测量器官重量数据，收集蛋白质、RNA和组织评估样本。在敲入小鼠中，与野生型小鼠相比，TAC 显示出左心室缩短率降低和心脏重量增加的趋势。关于体外实验，我们目前正在筛选siRNA文库，以寻找负责Bcl2-L-13 Ser272的激酶。将siRNA和转染试剂预先分配到96孔板中，并通过接种组成型表达HA-Bcl2-L-13的HEK293A细胞来进行反转染。给予CCCP 72小时后，用抗p-Bcl2-L-13(Ser272)抗体进行荧光免疫染色。使用Keyence BZ-X700的孔扫描功能进行自动成像，并对p-Bcl2-L-13（Ser272）阳性信号进行计数。使用图像J测量阳性信号的数量，并且那些显示信号数量减少的被保留作为候选。由于与DMSO施用组相比，CCCP施用组中观察到信号数量明显增加，因此我们相信我们已经建立了筛选系统并开始了文库筛选。该文库包含 708 个基因，需要评估 39 个 96 孔板才能进行完整分析。目前已完成一半以上的图版的摄影。