心臓におけるミトコンドリア分解制御機構の解明と心不全治療薬創薬に向けた基礎的検討

阐明心脏中线粒体分解控制机制以及治疗心力衰竭药物开发的基础研究

• 批准号: 22K16102
• 负责人: 村川 智一
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16102/
• 关键词: 心不全; オートファジー; マイトファジー; ミトコンドリアダイナミクス

in vivo実験として、Bcl2-L-13 S272Aノックインマウスを用いて横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷誘導性心不全モデルを作製した。手術後１週、２週、４週で心エコーを行い、４週目で臓器重量のデータを計測するとともに、タンパク質・RNA・組織評価のためのサンプルを採取した。ノックインマウスでは、野生型マウスに比してTACにより左室短縮率の低下及び心重量の増加傾向を認めた。in vitro実験については、Bcl2-L-13 Ser272の責任kinaseを探索するため、siRNAライブラリのスクリーニングを進めている。あらかじめ96 well plateにsiRNA及びtranfection試薬を分注しておき、HA-Bcl2-L-13恒常発現HEK293A細胞を播種することでリバーストランスフェクションを行った。72時間後にCCCPを投与した後、抗p-Bcl2-L-13(Ser272)抗体による蛍光免疫染色を行った。Keyence BZ-X700のウェルスキャン機能を用いて自動撮影を行い、p-Bcl2-L-13(Ser272)陽性シグナルをカウントした。Image Jにより陽性シグナル数を計測し、シグナル数の減少が見られるものを候補として残すこととした。DMSO投与群に対してCCCP投与群で確実にシグナル数の増加が見られたことから、スクリーニングシステムが確立できたと考え、ライブラリスクリーニングを開始している。このライブラリは、708の遺伝子を含んでおり、全解析に39枚の96wellプレートの評価が必要である。現在約半数を超えるプレートにつき撮影を終了している。

作为一个体内实验，使用Bcl2-L-13 S272A敲入小鼠制备了通过横向主动脉变高（TAC）的压力诱导的心力衰竭模型。在手术后的1、2和4周进行超声心动图，并在4周时测量器官重量数据，并收集样品以进行蛋白质，RNA和组织评估。在敲门小鼠中，与野生型小鼠相比，TAC显示出左心室缩短率和心脏体重增加的速度降低。对于体外实验，我们目前正在筛选siRNA库，以搜索Bcl2-L-13 Ser272的负责任激酶。将siRNA和转染试剂提前分配到96个井板中，并通过在其稳态表达中表达HA-BCl2-L-13的HEK293A细胞播种逆转录。 CCCP 72小时后，用抗P-BCl2-L-13（SER272）抗体进行荧光免疫染色。使用Keyence BZ-X700的井扫描函数进行自动成像，并计数P-BCl2-L-13（SER272）正信号进行自动成像。使用图像j测量正信号的数量，并将信号数量减少的信号作为候选。与DMSO组相比，由于CCCP组的信号数量明显增加，因此建立了筛选系统，并且已经开始了库筛选。该库包含708个基因，需要评估39个96井板以进行所有分析。目前，超过一半的盘​​子完成了拍摄。