アミノ酸輸送体LAT1依存的リン酸化シグナルにおけるチロシンリン酸化制御機構解明

阐明氨基酸转运蛋白 LAT1 依赖性磷酸化信号中酪氨酸磷酸化的调节机制

基本信息

批准号：
22K15512
负责人：
岡西広樹
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

がん細胞では，細胞増殖等の調節に関わるタンパク質の翻訳後修飾リン酸化ネットワークの制御に異常が生じている．アミノ酸はこのリン酸化ネットワークを刺激するシグナル分子としての機能を持つ．がん細胞特異的アミノ酸トランスポーターLAT1は，がん特異的な細胞内環境形成に寄与するアミノ酸シグナル機構を構成しているものと考えられる．申請者はこれまで，固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) によるリン酸化濃縮法を用いたプロテオーム解析により，LAT1を起点としたリン酸化ネットワークを解明してきた．この方法は主にセリン・スレオニンのリン酸化動態の広範な解明には非常に有用である一方で，悪性腫瘍の発生に深く関与する受容体型・非受容体型チロシンキナーゼが触媒するチロシンのリン酸化は微量なため同定が難しく，より特異的な方法が必要であった．本年度では，まず (1) 非常に特異性の高い競合的LAT1阻害薬ナンブランラト (JPH203) により有意な抗腫瘍効果を評価済みの胆道がん細胞株3種類(KKU-055, KKU-100, KKU-213) において，タンパク質チロシンリン酸化ネットワーク変動に加えて、グローバルリン酸化ネットワーク変動および発現タンパク質変動を詳細に調べた．具体的には，LAT1阻害薬の添加の有無のそれぞれの条件で24 時間処理した細胞サンプルから，相間移動溶解剤による抽出法でタンパク質を抽出し，サンプル調製を行い，定量チロシンリン酸化・定量リン酸化プロテオーム解析による修飾動態差異解析，定量プロテオーム解析による発現差異解析に供した．これらの結果を統計学的抽出およびデータベース化し，統計学的に有意な発現変動分子群,およびリン酸化修飾変動分子群を分子ネットワーク解析ソフトIPAによって解析した．

在癌细胞中，参与调节细胞增殖的蛋白质的翻译后修饰磷酸化网络的调节发生异常。氨基酸充当刺激该磷酸化网络的信号分子。癌细胞特异性氨基酸转运蛋白 LAT1 被认为构成了一种氨基酸信号传导机制，有助于形成癌症特异性细胞内环境。迄今为止，本申请人已经通过使用固定化金属离子亲和层析(IMAC)的磷酸化富集方法的蛋白质组分析阐明了从LAT1开始的磷酸化网络。虽然这种方法对于广泛阐明丝氨酸和苏氨酸的磷酸化动力学非常有用，但值得注意的是，受体型和非受体型酪氨酸激酶催化的酪氨酸磷酸化，与恶性肿瘤的发展密切相关，由于数量少，鉴定困难，需要更具体的方法。今年，我们将首先（1）研究三种胆道癌细胞系（KKU-055、KKU-100、KKU-213），除了蛋白质酪氨酸磷酸化网络波动外，还研究了全局磷酸化网络波动和表达蛋白质波动。细节。具体而言，从添加和未添加LAT1抑制剂处理24小时的细胞样品中，通过使用相转移裂解剂的提取方法提取蛋白质，进行样品制备，并进行定量酪氨酸磷酸化和定量磷酸化。氧化蛋白质组分析用于分析修饰动力学，定量蛋白质组分析用于分析表达差异。将这些结果进行统计提取并编入数据库，并使用分子网络分析软件IPA对具有统计显着性的表达变异分子和磷酸化修饰分子进行分析。