医療応用可能なCRISPR-Cas12aによる欠失導入法の確立

建立具有医学应用价值的使用CRISPR-Cas12a的缺失导入方法

基本信息

批准号：
22K15386
负责人：
高橋剛
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15386/
关键词：
CRISPR-Cas12s 欠失導入 CRISPR-Cas12a ゲノム編集欠失変異 iPS細胞筋ジストロフィー

项目摘要

本研究は、CRISPR-Cas12a（以下、Cas12a）による高い再現性と誘導効率をもつ欠失変異導入法の確立を目指す。研究代表者は、Cas12aが標的DNA配列の切断時に5’突出末端を形成させる点に着目し、突出配列が相補的となる2つの標的を選択することで、末端が結合される正確な欠失導入が可能であることを見出した。さらに、突出末端の配列から、結合後の配列が予測できることを示唆する結果を得た。そこで本研究では、突出配列の組み合わせを網羅的に解析することで、再現性が最も高い欠失導入条件を同定する。また、Cas12aのガイドRNA多重発現能力を利用して、欠失させるDNAを断片化することで、欠失導入率を向上させる。最終的に、筋ジストロフィー患者由来iPS細胞において、本技術の遺伝子治療への応用を試みる。2022年度は、ガイドRNAの多重発現による欠失DNAの断片化が、欠失導入効率を向上させるか検討を進めた。さらに、Cas12aに加えて、よりヒト細胞での編集活性が強く、オフターゲット効果が抑制されたenCas12およびenCas12-HF1の二種類の改変体も利用した。DNA断片化を介した欠失導入のために、通常の2つの標的に加えて、欠失させるDNAフラグメント内にさらに2ヶ所・4ヶ所の標的を設定した。その結果、断片化のためのガイドRNAが発現し、狙い通りに欠失させるDNAフラグメントを切断したことを確認した。しかし、このDNA断片化は、欠失導入効率の向上には寄与しなかった。また、enCas12aとenCas12a-HF1を利用したことで、通常の2標的切断による欠失導入効率の向上が認められたが、これらの改変体においても、ガイドRNAの多重発現によるDNA断片化で欠失導入率は改善しなかった。

本研究旨在建立一种具有高重复性和诱导效率的利用CRISPR-Cas12a（以下简称Cas12a）的缺失突变导入方法。主要研究人员关注的是Cas12a在切割靶DNA序列时形成5'突出端这一事实，通过选择突出序列互补的两个靶标，研究人员创建了末端连接的精确缺失，我们发现这是可能的。来介绍一下这个方法。此外，我们获得的结果表明，可以从突出端的序列预测连接后的序列。因此，在本研究中，我们将全面分析突出序列的组合，以确定具有最高重现性的缺失引入条件。此外，利用Cas12a的指导RNA多重表达能力，对待删除的DNA进行片段化，提高了删除引入率。最后，我们将尝试将该技术应用于利用肌营养不良症患者的 iPS 细胞进行基因治疗。在2022财年，我们研究了通过引导RNA的多重表达对删除的DNA进行片段化是否会提高删除引入效率。此外，除了Cas12a之外，我们还使用了两种变体enCas12和enCas12-HF1，它们在人体细胞中具有更强的编辑活性并抑制脱靶效应。为了通过DNA片段化引入删除，除了通常的两个目标之外，在要删除的DNA片段内设置了两个和四个额外的目标。结果，确认了用于片段化的指导RNA被表达，并且待删除的DNA片段被如所希望地切割。然而，这种DNA片段化并没有有助于提高缺失引入的效率。此外，通过使用enCas12a和enCas12a-HF1，我们观察到通过传统的双靶标切割引入缺失的效率有所提高，但即使在这些变体中，也可以通过引导RNA的多重表达引起的DNA片段化来进行缺失。采用率没有提高。