時間分解構造解析によるアミロイド脱凝集メカニズムの研究

通过时间分辨结构分析研究淀粉样蛋白解聚机制

基本信息

批准号：
22K15067
负责人：
野村高志
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15067/
关键词：
アミロイド赤外分光法クライオ電子顕微鏡構造解析

项目摘要

本研究では、アミロイドの脱凝集過程におけるタンパク質の動きを分子レベルで可視化し、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。その為、本研究の基盤となる①酵母由来Sup35アミロイドの構造決定、②時間分解赤外分光測定および時間分解クライオ電子顕微鏡単粒子解析に最適な脱凝集反応条件の決定、③時間分解赤外分光測定のための高速混合マイクロフローセルの開発に注力した。Sup35は2種類のアミロイド（Sc4、Sc37）を形成する。クライオ電子顕微鏡実験では均一な試料を調製する事が必須である。サンプルの調製方法を改良することで均一な試料を調製できていることを質量分析で確認できたので、クライオ電子顕微鏡で観測したところ、両アミロイドの構造を高分解能で決定した。この2種類のアミロイドの構造は大きく異なっており、全反射照明顕微鏡で明らかとなっていた脱凝集反応の違いを説明しうる重要な知見を得る事ができた。また、時間分解赤外分光測定およびクライオ電子顕微鏡による時間分解構造解析に向けた脱凝集反応条件の最適化のために、チオフラビンTによる脱凝集アッセイを行なった。これにより本研究で最適な反応条件を決定する事ができた。しかし、この条件でSup35アミロイド/Ssa1/Sis1複合体を調製し、クライオ電子顕微鏡で観測したが、余剰のシャペロンがクライオ電子顕微鏡画像のコントラストを低下させてしまい、構造決定には至らなかった。時間分解赤外分光測定については、アミロイドの脱凝集反応を実時間で追跡するために、高速混合マイクロフローセルを開発した。このセルを利用して時間分解赤外分光測定により脱凝集反応を観測したところ、シャペロンの構造変化に由来するタンパク質の構造変化を捉える事ができたが、アミロイドの構造変化を捉えることはできなかった。

本研究的目的是在分子水平上可视化淀粉样蛋白解聚过程中的蛋白质运动，并阐明其分子机制。因此，本研究的基础是（1）酵母源 Sup35 淀粉样蛋白的结构测定，（2）确定时间分辨红外光谱和时间分辨冷冻电子显微镜单颗粒分析的最佳解聚反应条件，以及（3 ）时间分辨红外光谱法我们专注于开发用于测量的高速混合微流动池。 Sup35 形成两种类型的淀粉样蛋白（Sc4 和 Sc37）。在冷冻电子显微镜实验中，制备均匀的样品至关重要。他们通过质谱分析证实，通过改进样品制备方法，他们能够制备出均一的样品，并且通过用冷冻电子显微镜观察，他们能够以高分辨率确定两种淀粉样蛋白的结构。这两种类型的淀粉样蛋白的结构显着不同，我们能够获得重要的知识来解释全内反射照明显微镜所揭示的解聚反应的差异。此外，为了优化时间分辨红外光谱和使用冷冻电子显微镜进行时间分辨结构分析的解聚反应条件，我们使用硫代黄素 T 进行了解聚测定。这使我们能够确定本研究中的最佳反应条件。然而，当在这些条件下制备Sup35淀粉样蛋白/Ssa1/Sis1复合物并使用冷冻电子显微镜观察时，由于过量的分子伴侣降低了冷冻电子显微镜图像的对比度，因此无法确定其结构。对于时间分辨红外光谱，我们开发了一种高速混合微流动池来实时跟踪淀粉样蛋白解聚反应。当我们使用时间分辨红外光谱观察该细胞的解聚反应时，我们能够检测到伴侣结构变化引起的蛋白质结构变化，但我们无法检测到淀粉样蛋白的结构变化。