酵母O-結合型糖鎖の代謝機構解明に向けた新規エンドO-マンノシダーゼの同定

鉴定一种新型内切-O-甘露糖苷酶，用于阐明酵母 O-连接糖链的代谢机制

基本信息

批准号：
22K15066
负责人：
小山亮祐
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

真核生物のO-結合型糖鎖は、タンパク質のSer/Thr残基を修飾する糖鎖であり、様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。近年、その生合成経路については解明されつつあるが、その代謝系についてはほとんど知られていない。その中でもヒトから酵母までその存在が知られているO-マンノース型(OM)糖鎖の代謝機構の知見は全ての生物種で皆無である。それに対し当研究室では、出芽酵母においてタンパク質に付加されたOM糖鎖を切断・遊離させる新規の“エンド-O-マンノシダーゼ(EOMase)”様の酵素活性を発見した。そこで、本研究ではこのEOMase遺伝子および酵素の同定を行い、それらの機能解析を行うことで、O-結合型糖鎖代謝機構の解明を目的とした。本目的に対し、初めに「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」と「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」の二つを試みている。「実験1」では、EOMaseの酵素活を直接的に観察するために、異なる構造を持つ三種類の基質を合成していただいた。本基質を活用し、HPLCでの活性検出の条件、および酵母細胞ライセートを用いた酵素活性検出の条件の検討を行った。その結果、HPLCの条件検討は完了したため、酵素活性検出の条件検討を行っている。「実験2」では、EOMase遺伝子の破壊によって遊離糖鎖が生産されないことが予想されたことから、昨年度までで非必須遺伝子約5000遺伝子中1041遺伝子の破壊株で解析を行った。その結果、EOMase遺伝子の同定には至っていないが、野生株に比べて極端に遊離OM糖鎖生成量が少ない二つの株を見出した。

真核生物的O型糖链是一种修饰蛋白质ser/thr残基的糖链，已知与各种生物学过程深深涉及。近年来，现场合成途径已被阐明，但新陈代谢系统却鲜为人知。其中，O-甘露糖型（OM）糖链的代谢机制（从人类到酵母）都不是所有的生物物种。另一方面，实验室发现了一种新的“末端-o-manno-shidase”的酶活性，该酶的活性切割并分离了发芽酵母中蛋白质中添加到蛋白质中的OM糖链。因此，在这项研究中，鉴定了Eomase基因和酶，并通过执行其功能分析来阐明O型型糖链代谢机制的目的。为此，我们首先尝试了两种类型：“实验1.蛋白酶活性检测试验建立”和“实验2。通过遗传破坏的熟练剂分析探索Eomase基因基因”。在“实验1”中，合成了三种具有不同结构的底物，以直接观察Eomase酶。利用该基材，检查了HPLC中活性检测的条件以及使用许可酵母细胞的酶活性检测条件。结果，由于检查了HPLC条件，因此正在检查酶活性检测的状况。在“实验2”中，预计Eomase基因的破坏不会产生长矛糖链。结果，尚未鉴定出Eomase基因，但发现与野生菌株相比，有两份极低的OM糖链出生。