植物寄生性センチュウ孵化誘引物質の生合成解明による高生産系統の作出

通过阐明植物寄生线虫孵化引诱剂的生物合成创建高产菌株

基本信息

批准号：
22K14894
负责人：
岡本拓実
金额：
$ 2.75万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

世界中で甚大な被害をもたらしているジャガイモシストセンチュウ（potato cystnematode: PCN）の孵化誘因物質として知られているsolanoeclepin A（solA）の生合成遺伝子・経路の同定を目指した。これまでに、ナス科植物を用いたゲノムのリシーケンシングや孵化活性に準じたトランスクリプトーム解析を行うことによって、いくつかの遺伝子を候補遺伝子として挙げていた。そこで、それらの遺伝子を対象にRNAiやCRISPR-Cas9システムを用いた遺伝子操作やNicotiana benthamianaを宿主とした遺伝子の一過性発現によるin vivo試験を行うことで、候補遺伝子の機能解析を行った。形質転換については、まずは様々な書籍、文献を参考にして実験条件を設定し、実験を行った。しかしながら、所望の形質転換体を獲得することができなかった。そこで、形質転換体を作出するために使用している抗生物質（ハイグロマイシンB）の濃度をいくつか条件検討を行い、培地に含有しているスクロースの量も検討した。その結果、当研究室において最適な条件を獲得でき、現在は順調に進行している。異宿主発現については、まず候補遺伝子を一過性で発現させるための発現ベクターに導入した。その後、アグロインフィルトレーション法を用いることで、Nicotiana benthamianaに発現させた。それを各種有機溶媒を用いて抽出し、HPLCなどの解析機器にて生産している化合物の確認、また、遺伝子の機能解析を行った。現在は解析が終わっているものもあるが、最終生成物であるsolAが微量生成物であると同時に、中間体と思われる化合物の微量であると考えられるので、解析に時間がかかっている。

我们的目的是确定茄菌素 A (solA) 的生物合成基因和途径，茄菌素 A 被称为马铃薯胞囊线虫 (PCN) 的孵化诱导剂，在世界各地造成巨大损害。到目前为止，通过利用茄科植物进行基因组重测序和基于孵化活动的转录组分析，已将几个基因鉴定为候选基因。因此，我们通过使用RNAi和CRISPR-Cas9系统对这些基因进行遗传操作，并使用本塞姆氏烟草作为宿主，使用瞬时基因表达进行体内测试，对这些候选基因进行了功能分析。关于转化，我们首先参考各种书籍和文献设定实验条件并进行实验。然而，未能获得所需的转化体。因此，我们检查了有关用于产生转化体的抗生素（潮霉素B）浓度的几个条件，并且还检查了培养基中所含的蔗糖量。因此，我们的实验室能够获得最佳的条件，目前该项目进展顺利。对于异宿主表达，首先将候选基因引入表达载体中进行瞬时表达。此后，使用农杆菌渗透法在本塞姆氏烟草中表达它。使用各种有机溶剂对其进行提取，使用HPLC等分析设备确认生成的化合物，并对基因的功能进行分析。一些分析现已完成，但分析需要时间，因为最终产物 solA 是一种少量的产物，同时它被认为是一种微量的化合物，该化合物被认为是成为中间人。