CCN2-oriented anti-cancer drug screening

面向CCN2的抗癌药物筛选

• 批准号: 21K17104
• 负责人: 堀江 尚弘
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Health Sciences University of Hokkaido
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K17104/
• 关键词: CCN2; shRNA; 骨芽細胞; ゲノム編集; 口腔扁平上皮癌; iPS細胞; 抗がん剤

本研究は結合組織増殖因子（CTGF/CCN2）に着目して，がん細胞におけるCCN2の発現機構を応用することで「新たな抗がん剤を探索すること」を目的としている．本年度は細胞にCRISPR/Cas9 システムを応用したゲノム編集を施し，CCN2遺伝子発現をGFPの蛍光にて検知可能な，CCN2レポーター細胞を樹立することを計画していたが，まず予備検討としてCCN2遺伝子をノックダウンした際の細胞への影響を，骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞にshRNA技術を応用し解析した．MC3T3-E1細胞にCCN2遺伝子のshRNAを施したことにより，CCN2遺伝子発現が低下した細胞株；sh(+)を樹立できた．sh(+)とshコントロール細胞；sh(-)とを比較したところ，細胞形態に明らかな違いは認めなかったが，細胞増殖能についてはsh(+)の方が低下していた．骨関連遺伝子発現(Runx2，Col1，Bglap)はsh(+)群で高発現しており，CCN2関連タンパク質であるβ-CATENIN，MRTF-Aのタンパク質量もsh(+)群で多い傾向にあった．また，骨分化誘導実験においてsh(+)群でALP陽性細胞は多く認められ，MC3T3-E1細胞におけるCCN2遺伝子のノックダウンが同細胞の骨への分化を促進していたため，CCN2は骨芽細胞の骨分化を抑制することが想定された．加えて，樹立した細胞は先行研究から推定されたCCN2関連タンパク質の発現傾向を示しており，骨分化に関与するシグナル伝達の研究・創薬研究への応用が期待される。本進捗状況を2023年3月23日～25日に国立京都国際会館にて開催された，第22回日本再生医療学会総会にて発表した(発表表題；下顎骨発生におけるCTGFの関与について)．

这项研究的重点是结缔组织生长因子（CTGF/CCN2），旨在通过在癌细胞中应用CCN2表达的机制来“探索新的抗癌药物”。今年，我们计划使用CRISPR/CAS9系统对细胞进行基因组编辑，以建立CCN2报告基细胞，该细胞可以通过GFP荧光检测CCN2基因表达。首先，作为一项初步研究，我们通过应用SHRNA技术分析了CCN2基因敲低对成骨细胞系的细胞的影响。通过将shRNA应用于MC3T3-E1细胞对CCN2基因，建立了SH（+），从而降低了CCN2基因表达。将SH（+）与SH对照单元进行比较时； Sh（ - ），细胞形态没有明显的差异，但是SH（+）的细胞增殖能力降低了。与骨相关的基因表达（RUNX2，COL1，BGLAP）在SH（+）组中高度表达，并且在SH（+）组中，CCN2相关蛋白β-catenin和MRTF-A的蛋白质量往往更高。此外，在诱导成骨的实验中，在SH（+）组中观察到许多ALP阳性细胞，而MC3T3-E1细胞中CCN2基因的敲低却促进了同一细胞的分化，因此假设CCN2抑制了CCN2抑制了成骨细胞骨分化。此外，已建立的细胞显示了从以前的研究中得出的CCN2相关蛋白的表达趋势，预计将应用于与骨分化有关的信号的研究和药物发现研究。这一进展是在3月23日至2023年25日在国家京都国际大厅举行的日本再生医学学会第22大会上提出的（介绍标题：关于CTGF参与下颌发展）。

项目成果

下顎骨発生におけるCTGFの関与について

关于CTGF参与下颌骨发育

• 发表时间: 2023
• 作者: Yoshida Hisato;Sakashita Masafumi;Adachi Naoto;Matsuda Shinpei;Fujieda Shigeharu;Yoshimura Hitoshi;堀江 尚弘，北川 孝雄，Ekayani Nasrun Nisrina，永易 裕樹，志茂 剛
• 通讯作者: 堀江 尚弘，北川 孝雄，Ekayani Nasrun Nisrina，永易 裕樹，志茂 剛