Novel Development of Gene Delivery for Inner Ear -Dual Vector Method-

内耳基因传递的新进展-双载体方法-

• 批准号: 21K16832
• 负责人: 大道 亮太郎
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16832/
• 关键词: アデノ随伴ウイルス; 有毛細胞; 遺伝性難聴; 遺伝子治療; 内耳; 感音難聴; 内耳遺伝子導入; 遺伝子導入; 遺伝子発現

これまでの検討で、蝸牛が成熟している生後4週目の野生型マウスに対し、Round window membrane + Canal fenestration法（以下RWM+CF法）で２種類のAdeno associated virus (以下AAV)を内耳に導入した。血清型タイプ２（以下AAV2）、血清型タイプ９（以下AAV9）を用い、それぞれのベクターには蛍光タンパクであるeGFP（緑色蛍光）とmCherry（赤色蛍光）を組み込んだ。その際の濃度は先行研究での濃度に合わせるように、各ベクター濃度はその半分の濃度とした。具体的な濃度は以下の通りである。AAV2- EGFP at 1.84 _ 10^12 GC/mL, AAV2-mCherry at 1.07 _ 10^12 GC/ mL, AAV9-EGFP at 1.2 _ 10^12 GC/mL, AAV9-mCherry at 1.24 _ 10^12 GC/mL。注射後２週間目に聴性脳幹反応で聴力を評価したところ、注射された側の耳と対側の未治療の耳を比較し、低音域から高音域にかけて明らかな聴力低下を認めず、Dual transductionによる聴毒性は認めないと判断した。聴力を評価した後に安楽死させた上で、側頭骨を採取し、内耳を取り出し、固定した。免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による内有毛細胞及び外有毛細胞への感染率を検討した。AAV2同士の組み合わせでは内有毛細胞への導入効率は96.92%とsingleの場合と同様の高効率であった。外有毛細胞に対しては、ApexとMiddleにおいて90%以上の高効率を認めた一方で、Baseに関しては効率が低下しており、全体としては65.59%と他家の報告よりも高値ではあったが、singleの効率と比較すると低下を認めた。AAV2によるDual transductionは有毛細胞においてsingleと同様に高率に導入されており、遺伝子治療における高い有用性が示唆された。

在先前的研究中，使用圆形窗户 +运河式塞术方法（RWM + CF方法）将两种类型的Adeno相关病毒（AAV）引入内耳中，这些小鼠在4周龄时就成熟。使用了血清型2（以下称为AAV2）和9型血清型（以下称为AAV9），并将荧光蛋白EGFP EGFP（绿色荧光）和MCHERRY（红色荧光）掺入每个载体中。此时的浓度设置为每个载体的浓度一半，以便在先前的研究中与浓度相匹配。特定浓度如下：AAV2-EGFP在1.84 _ 10^12 gc/ml，aav2-mcherry，1.07 _ 10^12 gc/ml，aav9-egfp at 1.2 _ 10^12 gc/ml，aav9-mcherry，aav9-mcherry，Aav9-mCherry，at 1.24 _ 10^12 gc/ml。当注射两周后使用听觉脑干反应评估听力能力时，比较了对侧侧的注射耳朵和未经处理的耳朵，并且在低至高范围内未观察到明显的听力损失，并且由于双传递而没有观察到骨毒性。评估了听力，其次是安乐死，并收集颞骨，去除内耳并固定。进行免疫染色，并通过共聚焦激光显微镜检查内部和外毛细胞的感染率。当组合AAV2时，将内毛细胞的转移效率为96.92％，与单个相同。在外毛细胞中，高效率高于最高和中间的90％以上，而基本的效率降低了，总体上为65.59％，高于其他人的报告，但与单人的效率相比，降低了。 AAV2的双重转移在毛细胞中以很高的速度引入，类似于单个细胞，这表明其在基因治疗中的效用很高。