HIV-1タンパク質とRNAによるウイルス粒子形成メカニズムの解明

阐明HIV-1蛋白和RNA形成病毒颗粒的机制

基本信息

批准号：
21K16324
负责人：
中村朋文
金额：
$ 3万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16324/
关键词：
HIV-1 HIV-1　タンパク質 HIV-1 RNA NCINIs HIV-1形態 HIV-1 タンパク質 HIV-1 形態相分離現象

项目摘要

Non-catalytic site integrase inhibitors（NCINIs）の変異体解析：NCINIsはINとHIV-RNAの結合を阻害する薬剤である。本研究では、NCINIs耐性アミノ酸変異を有するHIV-1 cloneの解析を行った。Integrase(IN)内のNCINIs耐性アミノ酸変異であるp26変異(A128T,H171Q,K173Q,N254K)は、NCINIsに関連する耐性変異であり、p26変異を有するHIV-1-IN・p26 cloneはHIV-1への感染性が低下していた。共存して認められたNucleocapsid(NC)内の変異であるD48Nは、明らかなNCINIsに対する耐性化を認めておらず、一方でHIV-1-NC・D48N cloneの細胞感染性を軽度上昇させていた。しかし、IN内のp26とNC内のD48Nの変異を両方有するクローンは、HIV-1の感染性および複製能が低下した。それぞれの変異体に関して逆転写効率を確認したところ、NC・D48N変異とIN・p26の変異をもつクローンはその逆転写効率が極端に低下していた。これは、NCとINが協調して逆転写に影響していることを示唆する所見である。蛍光複合体（SNAP-448-NC 、SNAP-546-IN ）の相分離現象の解析：HIV-1由来のタンパク質の相分離現象を確認するために蛍光物質（SNAP-Surface 488または546）をHIV-1タンパク質に結合させた複合体に関してE.coliを用いて精製・作成した。野生株に加えて、上述したNCINIs 変異株が相分離現象にどのような影響与えるか？変異体の作成も行った。NCは水溶性の乏しい不安定なタンパク質であり、非常に精製が困難であった。SNAP-INおよびSNAP-NCの野生株と変異株を蛍光顕微鏡を用いて、時間及び空間的な計測および解析を行ったが、沈殿が多く未だ解析が困難である。

非催化位点整合酶抑制剂 (NCINIs) 的变异分析：NCINIs 是抑制 IN 与 HIV-RNA 结合的药物。在这项研究中，我们分析了具有对 NCINI 具有抗性的氨基酸突变的 HIV-1 克隆。 p26突变（A128T、H171Q、K173Q、N254K）是整合酶（IN）中的NCINIs抗性氨基酸突变，是与NCINIs相关的抗性突变，具有p26突变的HIV-1-IN・p26克隆是HIV- 1 传染性正在下降。观察到共存的核衣壳（NC）突变D48N并未引起对NCINI的明显耐药性，但另一方面，它略微增加了HIV-1-NC/D48N克隆的细胞感染性。然而，IN 中的 p26 突变和 NC 中的 D48N 突变的克隆降低了 HIV-1 的感染性和复制能力。当我们检查每个突变体的逆转录效率时，我们发现具有NC/D48N突变和IN/p26突变的克隆的逆转录效率极低。这一发现表明 NC 和 IN 合作影响逆转录。荧光复合物（SNAP-448-NC、SNAP-546-IN）的相分离现象分析：为了确认来自HIV-1的蛋白质的相分离现象，添加了荧光物质（SNAP-Surface 488或546） HIV 与-1蛋白结合的复合物是使用大肠杆菌纯化和创建的。除野生型菌株外，上述NCINIs突变菌株如何影响相分离现象？我们还创造了突变体。 NC 是一种不稳定的蛋白质，水溶性差，纯化极其困难。我们使用荧光显微镜对SNAP-IN和SNAP-NC的野生型和突变株进行了时间和空间测量和分析，但由于大量沉淀物，分析仍然很困难。