Machanistic analysis of Ca2+ elevation before the terminal differentiation (cell death) of cutaneous epithelial cells

皮肤上皮细胞终末分化（细胞死亡）前Ca2+升高的机制分析

基本信息

批准号：
21K16226
负责人：
村田光麻
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Hyogo Medical University (2022)Kyoto University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

陸上脊椎動物は皮膚によって外界から保護されており、そのバリア機能のために最も重要な構造は角層と呼ばれる死細胞のシートである。角層は、皮膚上皮細胞が角化と呼ばれるプログラム細胞死を起こして形成されるが、その誘導メカニズムはほとんど分かっておらず、角化の異常をきたす疾患の特異的な治療法はない。本研究では、皮膚上皮細胞が角化の直前に細胞質カルシウムイオン濃度を上昇させるという現象を手がかりとする。定常状態で角化直前に上昇する細胞質カルシウムイオンの由来を同定し、角化におけるカルシウムイオンの役割を明らかにするとともに、その移動を担う分子を突き止めることを目標とする。本研究では、阻害薬スクリーニングとCRISPRスクリーニングを用いて、上記の課題に取り組む。阻害薬スクリーニングでは、培養角化細胞に発現する分子のスクリーニングの結果に基づいて、発現の高い分子に関する阻害薬を順に用いていく。CRISPRスクリーニングでは、カルシウムイオン濃度を可視化するGCaMP3を指標として、順遺伝学的スクリーニングを実施する。2022年度は、研究代表者の異動と、新型コロナウイルスへの自身の感染や対応のため、あまり研究を進めることができなかったが、以下の内容を行った。遺伝子組み換え実験の学内申請と承認。CRISPRスクリーニングのためのgRNAデザインの方法を立ち上げた。CRISPRスクリーニングで用いる培養細胞に必要な遺伝子を、Lentivirus vectorを用いて導入した。また、スクリーニングのアウトプットの部分で必要な次世代シーケンサーを用いた、カスタム解析を実行できるよう、技術を習得した。

陆生脊椎动物受到皮肤的保护，免受外界的保护，其屏障功能最重要的结构是一片被称为角质层的死细胞。当皮肤上皮细胞发生程序性细胞死亡（称为角化化）时，形成角质层，但诱导的机理在很大程度上是未知的，并且对引起异常角化的疾病没有特定的治疗方法。这项研究表明，皮肤上皮细胞在角化作用之前会增加细胞质钙离子浓度的现象。目的是确定在稳定状态之前在角质化之前上升的细胞质钙离子的起源，阐明钙离子在角化作用中的作用，并确定负责其迁移的分子。这项研究解决了使用抑制剂筛查和CRISPR筛查的上述挑战。在抑制剂筛选中，根据筛选在培养的角化细胞中表达的分子的结果顺序使用高表达分子的抑制剂。在CRISPR筛选中，使用GCAMP3进行正向基因筛选，该筛选可将钙离子浓度视为指标。在2022年，由于主要研究人员的转移以及他自己的感染以及对新冠状病毒的反应，我们无法进行大量研究，但我们进行了以下信息。校园内应用和批准遗传修饰实验。我们已经推出了一种用于CRISPR筛查的GRNA设计方法。使用慢病毒载体引入了用于CRISPR筛选的培养细胞所需的基因。他还获得了使用筛选输出部分所需的下一代音序器进行自定义分析的技术。