Machanistic analysis of Ca2+ elevation before the terminal differentiation (cell death) of cutaneous epithelial cells

皮肤上皮细胞终末分化（细胞死亡）前Ca2+升高的机制分析

基本信息

批准号：
21K16226
负责人：
村田光麻
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Hyogo Medical University (2022)Kyoto University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

陸上脊椎動物は皮膚によって外界から保護されており、そのバリア機能のために最も重要な構造は角層と呼ばれる死細胞のシートである。角層は、皮膚上皮細胞が角化と呼ばれるプログラム細胞死を起こして形成されるが、その誘導メカニズムはほとんど分かっておらず、角化の異常をきたす疾患の特異的な治療法はない。本研究では、皮膚上皮細胞が角化の直前に細胞質カルシウムイオン濃度を上昇させるという現象を手がかりとする。定常状態で角化直前に上昇する細胞質カルシウムイオンの由来を同定し、角化におけるカルシウムイオンの役割を明らかにするとともに、その移動を担う分子を突き止めることを目標とする。本研究では、阻害薬スクリーニングとCRISPRスクリーニングを用いて、上記の課題に取り組む。阻害薬スクリーニングでは、培養角化細胞に発現する分子のスクリーニングの結果に基づいて、発現の高い分子に関する阻害薬を順に用いていく。CRISPRスクリーニングでは、カルシウムイオン濃度を可視化するGCaMP3を指標として、順遺伝学的スクリーニングを実施する。2022年度は、研究代表者の異動と、新型コロナウイルスへの自身の感染や対応のため、あまり研究を進めることができなかったが、以下の内容を行った。遺伝子組み換え実験の学内申請と承認。CRISPRスクリーニングのためのgRNAデザインの方法を立ち上げた。CRISPRスクリーニングで用いる培養細胞に必要な遺伝子を、Lentivirus vectorを用いて導入した。また、スクリーニングのアウトプットの部分で必要な次世代シーケンサーを用いた、カスタム解析を実行できるよう、技術を習得した。

陆地脊椎动物通过皮肤保护自己免受外界侵害，而这种屏障功能最重要的结构是一层称为角质层的死细胞。角质层是在皮肤上皮细胞经历称为角化的程序性细胞死亡时形成的，但其诱导机制很大程度上未知，并且对于引起异常角化的疾病也没有具体的治疗方法。在本研究中，我们以皮肤上皮细胞在角化前细胞质钙离子浓度升高的现象为线索。我们的目标是确定在角质化之前稳态上升的细胞质钙离子的起源，阐明钙离子在角质化中的作用，并确定负责其运动的分子。在本研究中，我们将利用抑制剂筛选和CRISPR筛选来解决上述问题。在抑制剂筛选中，根据培养角质形成细胞中表达的分子的筛选结果，依次使用与高表达分子相关的抑制剂。在 CRISPR 筛选中，使用 GCaMP3 进行正向遗传筛选，GCaMP3 可将钙离子浓度可视化作为指标。 2022年，由于主要研究者的调动以及我自己对新型冠状病毒的感染和反应，我未能推进太多研究，但我做了以下工作：校内申请并批准基因改造实验。我们推出了用于 CRISPR 筛选的 gRNA 设计方法。使用慢病毒载体引入用于 CRISPR 筛选的培养细胞所需的基因。我还学习了能够使用下一代测序仪进行定制分析的技术，这对于筛选的输出部分是必需的。