空間的な単一細胞の遺伝子発現解析による始原生殖細胞の潜在的多能性の制御機構解明

通过空间单细胞基因表达分析阐明原始生殖细胞潜在多能性的调控机制

基本信息

批准号：
21K15107
负责人：
池田宏輝
金额：
$ 3万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、移動期の個々の始原生殖細胞とその周辺環境を構成する細胞の詳細な遺伝子発現解析により、生体内における適切な多能性や分化の制御機構、これに関わる微小環境との相互作用の分子基盤を解明することである。組織内における配置情報とリンクした単一細胞レベルでの詳細な遺伝子発現情報の取得手法の開発について、前年度に決定した手法を用いて、マウスの卵巣を包埋、脱水固定、染色し、卵胞中の卵母細胞、及びその卵母細胞に隣接する顆粒膜細胞と隣接しない顆粒膜細胞をLCMにより単一細胞レベルで切り出し、取得し、cDNA合成の後、定量的PCRによる主要遺伝子の定量により、固定切片上の単一細胞からのRNA回収とcDNA合成効率を評価した。その結果、これまで、培養細胞(マウスのES細胞)で得られていたことと同様に、卵母細胞、顆粒膜細胞の両者から網羅的な遺伝子発現を解析するに十分な質のcDNAを合成できていることが確認できた。さらに、当該cDNAよりNGSライブラリーを作製し、トランスクリプトームの詳細な解析したところ、各細胞において5000～15000程度の遺伝子が検出できていることが確認できた。このことは、我々が開発した手法を用いることで脱水固定し、染色した組織から単一細胞レベルでトランスクリプトームを詳細に解析することが可能であることを示唆している。加えて、単一の顆粒膜細胞のトランスクリプトームを卵母細胞からの位置情報と結び付けて解析することで、卵母細胞に隣接するか、卵母細胞より離れているかで同じ顆粒膜細胞であっても遺伝子発現プロファイルが異なっていることを見出した。

这项研究的目的是阐明体内适当多能性和分化控制机制的分子基础，以及在迁移阶段和周围环境中对单个原始生殖细胞的详细基因表达分析所涉及的微环境的相互作用。为了开发一种方法，用于在与组织中的位置信息相关的单个细胞水平上获取详细的基因表达信息，使用上一年确定的方法，将小鼠卵巢嵌入，脱水和染色，并染色，以及在卵泡和颗粒细胞中未与颗粒细胞相邻的细胞中的细胞，并在卵石中占据了颗粒细胞，并在粒细胞中占有，并吞噬了粒细胞，并吞噬了卵形的，并吞噬了卵形的，并吞噬了卵形的幼虫。 cDNA合成，从固定切片上的单个细胞中恢复RNA，通过定量测定主要基因通过定量PCR评估cDNA合成。结果，已经证实，与培养细胞（鼠ES细胞）获得的相似，从卵母细胞和颗粒细胞中合成了足够质量的cDNA，以分析综合基因表达。此外，从cDNA制备了NGS文库，对转录组的详细分析表明，每个细胞中可以检测到约5,000至15,000个基因。这表明，使用我们开发的方法，可以通过脱水固定从染色组织的单细胞水平上彻底分析转录组。另外，通过将单个颗粒细胞的转录组与卵母细胞的位置信息联系起来，我们发现基因表达谱即使在相同的颗粒细胞中，无论是与卵母细胞相邻还是与卵母细胞分离。