Genome-editing in hematopoietic cells with all-in-one HDAdV-CRISPR

使用一体化 HDAdV-CRISPR 对造血细胞进行基因组编辑

• 批准号: 18K15287
• 负责人: 和田 美加子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K15287/
• 关键词: 遺伝子治療; ウイルスベクター; ゲノム編集; 免疫不全症; 造血幹前駆細胞; SCID-X1; CRISPR

難治疾患である X 連鎖重症複合免疫不全症（SCID-X1）の治療法の確立を目指して、疾患原因である遺伝子変異を、CRISPR/Cas9とウイルスベクターを組み合わせて正確で高効率に修復する方法を検討した。SCID-X1の原因遺伝子であるIL2RGを標的とするCRISPR発現カセットと、IL2RGの全エクソンを含む正常配列、およびネオマイシン耐性遺伝子が一つのヘルパー依存型アデノウイルスベクター（HDAdV）に集約された“all-in-one vector”を用いて検討を行った。1.all-in-one vectorと、その比較対象群である①CRISPRタンパク質とガイドRNA複合体（RNP）＋ネオマイシン耐性遺伝子を含むIL2R2正常配列（修復用ドナー配列）とアデノ随伴ウイルス、②RNPとネオマイシン耐性遺伝子を含むIL2RG正常配列とHDAdVをそれぞれK562細胞株に導入した。遺伝子修復効率を調べるために修復用ドナー配列挿入部位とK562細胞染色体とのジャンクション部位やネオマイシン耐性遺伝子上にプライマーを設計しPCRを行った。その結果、all-in-one ベクターを用いたときはRNP+HDAdVより高い効率で遺伝子修復されている傾向にあった。2.実際ex vivo治療で用いられるヒト造血幹前駆細胞にall-in-oneを導入した後、メチルセルロースで細胞毒性を調べた。その結果修復実験を行っていない実験群と比べてコロニー数や種類の差はなく、細胞毒性の低い実験条件を決定した。

我们考虑建立一种治疗顽固性疾病X连锁严重联合免疫缺陷症（SCID-X1）的方法，通过结合CRISPR/Cas9和病毒载体来准确高效地修复导致该疾病的基因突变。将针对 IL2RG（SCID-X1 的致病基因）、包含 IL2RG 所有外显子的正常序列和新霉素抗性基因的 CRISPR 表达盒组装到单个辅助依赖性腺病毒载体（HDAdV）中。 -一个向量”。 1. All-in-one载体及其对照组：①CRISPR蛋白和引导RNA复合物（RNP）+含有新霉素抗性基因（修复供体序列）和腺相关病毒的IL2R2正常序列，②RNP和新霉素抗性IL2RG含有该基因的正常序列和HDAdV分别被引入K562细胞系中。为了检查基因修复效率，在修复供体序列插入位点与K562细胞染色体之间的连接位点以及新霉素抗性基因上设计引物，并进行PCR。因此，当使用一体化载体时，基因修复往往比 RNP+HDAdV 更有效。 2. 将all-in-one引入用于离体治疗的人类造血干祖细胞后，我们使用甲基纤维素检查了细胞毒性。结果，与未进行修复实验的实验组相比，集落的数量或类型没有差异，并且确定了低细胞毒性的实验条件。