クライオ電子顕微鏡によるヒト心筋細いフィラメントの高分解能構造解析

使用冷冻电子显微镜对人心肌细丝进行高分辨率结构分析

基本信息

批准号：
20K06588
负责人：
藤井高志
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

骨格筋や心筋の筋収縮・弛緩は細胞内カルシウムイオン濃度([Ca2+])によって制御されている。筋収縮・弛緩は太いフィラメントを構成するミオシンの頭部がアクチン・トロポニン・トロポミオシンからなる細いフィラメントと結合解離を繰り返すことで引き起こされる。神経からの電気信号により筋小胞体から放出されたCa2+はトロポニンに結合し、トロポミオシンを移動させてアクチン分子表面のミオシン結合部位を露出させ、ミオシン-アクチン相互作用を可能にして両者の滑り運動が開始すると考えられている（立体障害説）。このメカニズムを原子レベルで明らかにするために、我々はこれまでに、分解能5~7オングストローム分解能でカルシウム２状態の構造解明を行い２０２０年にNature Communicationsに発表した。この分解能をさらに原子レベルの分解能（３オングストローム）に向上し原子レベルの動態を追究するために本年度導入された最新鋭のCRYO ARM300（JEOL）によりデータ収集を行った。また、データ収集にのぞむにあたって、氷包埋試料のさらなる最適化検討を行った。具体的には添加する界面活性剤の濃度や種類の検討を行った。CRYO ARM300は冷陰極型電界放出銃を備え非常に質の高い電顕像を得ることができる。また、自動化が高度に進んでいるため、効率的に品質の高い画像を大量に取得できる。カルシウム存在下・非存在下の２状態の画像データをCRYO ARM300によりそれぞれ７０００枚ずつ取得した。

骨骼肌和心肌的肌肉收缩和舒张由细胞内钙离子浓度（[Ca2+]）控制。肌肉的收缩和松弛是由肌球蛋白头的反复结合和解离引起的，肌球蛋白头构成粗丝，细丝由肌动蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白组成。通过来自神经的电信号从肌浆网释放的Ca 2+ 与肌钙蛋白结合，移动原肌球蛋白，并暴露肌动蛋白分子表面上的肌球蛋白结合位点，使得肌球蛋白-肌动蛋白相互作用以及两者的滑动运动据信发生。（空间位阻理论）。为了在原子水平上阐明这一机制，我们迄今为止以5至7埃的分辨率阐明了钙2态的结构，并于2020年在《自然通讯》上发表。我们进一步将该分辨率提高到原子级分辨率（3埃），并使用今年推出的最先进的 CRYO ARM300 (JEOL) 收集数据，以研究原子级动力学。此外，在准备数据收集时，研究了冰包埋样品的进一步优化。具体来说，我们研究了要添加的表面活性剂的浓度和类型。 CRYO ARM300配备冷阴极场发射枪，可以获得极高品质的电子显微图像。此外，由于其高度自动化，因此可以有效地获取大量高质量图像。使用 CRYO ARM300 采集了存在钙和不存在钙两种状态下的 7000 个图像。