微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

扩展“非 DNA 切割”Target-AID 技术，实现微生物的全基因组分析

基本信息

批准号：
19J40073
负责人：
坂野聡美
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J40073/
关键词：
ゲノム編集合成生物学 CRISPR 遺伝子工学大腸菌

项目摘要

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うツールへと技術拡張し、応用・実用化に向けて研究を進めてきた。現在、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。そこで、本課題３年目では、まず、複数遺伝子への同時塩基置換の効率を上げるために、３～６種類の標的部位をもつCRISPR-gRNAプラスミドを同時に大腸菌に導入する際の培養条件検討と同時塩基置換の効率を調べた。様々な方法を試した結果、３～４遺伝子への同時塩基置換を確認することができたが、その置換効率は配列に依存しており、まったく置換されない配列というのもあった。今後は、プラスミドに頼らない遺伝子編集法の構築を検討する必要がある。次に、技術の拡張に向けて、標的1遺伝子変異導入を用いた、薬剤耐性菌の変異個所探索法の培養条件検討を行った。培養時の薬剤添加とゲノム編集を行うタイミングを試行錯誤した結果、薬剤耐性に関わる既知の遺伝子以外の配列がいくつか同定された。現在その配列情報に関しては解析中である。今後は、培養条件の再検討やスクリーニング法の改良などを行い、Target-AIDを用いた新規遺伝子スクリーニング法の構築を行う予定である。

这项研究旨在建立目标AID技术，该技术可以在不切割DNA的情况下进行基因组编辑，作为一种基本技术，将显着提高下一代合成生物学和基因工程。具体而言，通过简单地将基础剥离融合酶DCAS9-PMCDA1和序列识别模块CRISPR-GRNA介绍到原核生物中，该技术已扩展到一种工具，可以同时使用简单和高的可能性进行多个目标DNA进行编辑，并且用于应用和实用性和实用性。目前，可以将突变引入具有一定程度的效率的大肠杆菌基因组的一个基因。但是，一个问题是简化和提高多个目标DNA中同时基础替代的效率。因此，在这项任务的第三年中，为了提高多个基因中同时基础取代的效率，我们首先检查了当CRISPR-GRNA质粒（带有三个至六个目标位点）同时引入大肠杆菌的培养条件和同时基础替代的效率，以提高同时基础替代效率的效率。在尝试了各种方法之后，我们能够在3-4个基因中确认同时基础取代，但是替代效率取决于序列，并且根本没有替换一些序列。将来，有必要考虑不依赖质粒的基因编辑方法的构建。接下来，为了扩展技术，研究了一种使用靶标1基因突变引入来寻找耐药细菌突变的方法。在培养期间药物添加和基因组编辑时间的反复试验之后，发现了与耐药性相关的已知基因以外的几个序列。序列信息目前正在分析中。将来，我们计划重新检查培养条件并改善筛查方法，并使用目标AID实施新的遗传筛查方法。