微生物新薬開発を実現するTarget-AIDゲノム編集法による全ゲノム解析の確立

利用Target-AID基因组编辑方法建立全基因组分析，实现微生物新药开发

基本信息

批准号：
21K06136
负责人：
坂野聡美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06136/
关键词：
ゲノム編集大腸菌遺伝子工学 CRISPR 薬剤耐性

项目摘要

本研究は、自然突然変異を模した形で変異導入が可能なゲノム編集ツールTaget-AIDを用いた、ゲノムワイドスクリーニング法を確立し、その結果得られた微生物の生存システム等を詳細に解析することを目的とする。現在のところ、大腸菌の標的1遺伝子内には、ある程度効率よい変異導入が実現されている。そこで、本課題１年目では、このTarget-AIDを用いた薬剤耐性菌の変異個所探索の予備的実験を行った。CRISPR-gRNAを導入した大腸菌に薬剤選択圧をかけ、表現型に関わる新たな変異個所を探索することができるかどうか、条件検討を行った。rifampicin耐性関連遺伝子rpoB、fluoroquinolone耐性関連遺伝子gyrAを選定し、MIC assayにより各薬剤の最適濃度を決定した。次に、標的配列20塩基をランダムに設計してプラスミド型CRISPR-gRNAを構築し、大腸菌に導入した。各薬剤の選択圧下における大腸菌を集菌し、プラスミド抽出後、gRNA部分を次世代シーケンサーで配列解読した。その結果、rifampicin耐性大腸菌からはrpoB以外の特異配列、nalidixic acid耐性大腸菌からはgyrA以外の特異配列が、それぞれ複数同定された。これらは大腸菌ゲノム上に100%マッチはせず、類似配列が推定されるのみであった。次に、プラスミド抽出した大腸菌の全ゲノム配列の解読を試みたところ、機知の関連遺伝子以外の変異箇所を複数同定した。そのうちのいくつかは、先述の特異配列に依存した変異導入であることが確認された。しかし、その配列を含めて再構築したCRISPR-gRNAを再び大腸菌に導入したが、薬剤耐性を獲得することはできなかった。

这项研究将利用基因组编辑工具Taget-AID建立一种全基因组筛选方法，该方法可以模仿自然突变的方式引入突变，并将详细分析由此获得的微生物的生存系统。目前，大肠杆菌靶1基因已实现一定程度的有效诱变。因此，在这个项目的第一年，我们进行了初步实验，利用这个Target-AID寻找耐药菌的突变位点。我们检查了条件，看看是否有可能对引入了 CRISPR-gRNA 的大肠杆菌施加药物选择压力，并寻找与表型相关的新突变位点。筛选利福平耐药相关基因rpoB和氟喹诺酮耐药相关基因gyrA，通过MIC测定确定各药物的最佳浓度。接下来，通过随机设计20个碱基的靶序列构建质粒型CRISPR-gRNA，并将其导入大肠杆菌中。收集每种药物选择压力下的大肠杆菌，提取质粒后，使用下一代测序仪对 gRNA 部分进行测序。结果，在利福平抗性大肠杆菌中鉴定出了除rpoB之外的多个独特序列，并且在萘啶酸抗性大肠杆菌中鉴定出了除gyrA之外的多个独特序列。这些与大肠杆菌基因组没有 100% 匹配，仅推测相似的序列。接下来，当他们试图对从中提取质粒的大肠杆菌的整个基因组进行测序时，他们发现了除 chichi 相关基因之外的多个基因突变。其中一些突变被证实依赖于上述特定序列。然而，当他们将含有该序列的CRISPR-gRNA重新引入大肠杆菌时，它们无法获得耐药性。