Design and Synthesis of Firefly Luciferin Analogues to realize highly bright near infrared bioluminescence emission

萤火虫荧光素类似物的设计与合成实现高亮近红外生物发光

基本信息

批准号：
19J12615
负责人：
池田裕真
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12615/
关键词：
生物発光イメージング近赤外ルシフェリンルシフェラーゼ

项目摘要

生体深部をイメージング可能なホタル生物発光系の構築を目的とし，発光反応中間体に注目した発光輝度の向上可能性を検証した．ATPと誘導体との縮合体は高輝度化に成功したものの，安定性や精製手法の確立，単離収率における課題が明らかとなった．そこで，基質化学構造の改変による長波長化および発光輝度双方の達成を試みることとした．開発指針としてホタル生物発光基質を有機蛍光色素と捉え，有機蛍光色素にみられる構造改変手法を模倣した．１.環融合戦略を基盤とした近赤外発光ホタルルシフェリン誘導体群の創製近赤外領域の光は，水などの生体分子による阻害が少ないことから，生体イメージングにおいて望ましいとされる．本研究では，既存の近赤外誘導体を基盤とし，環状アミン構造を組み込んだ計６種類の誘導体NIRLucsを合成した．いずれも天然のホタルルシフェラーゼFlucによる酵素認識を受け，近赤外発光を示した．さらに，NIRLucsは細胞膜透過性を持ち，生細胞系においても近赤外発光を示すことが確認された．良好な発光活性・血中滞留性を示したNIRLuc2を皮下腫瘍担癌マウスモデルへ応用したところ，天然の基質と比べて約７倍（近赤外では１６倍）の発光輝度を示した．２.環状アミノ基アゼチジン置換による発光輝度向上の可否検証ホタル発光基質をPush-Pull型の蛍光色素と見立て，Twisted Intramolecular Charge Transfer（TICT）の抑制による発光輝度向上の可否について検証した．本研究では，異なるルシフェリンコアに対して，アゼチジニル基を導入した誘導体を計５種類合成し，ルシフェリンにおけるアゼチジニル基置換効果を評価した．このうちアゼチジニル基を導入したA-1は，ジメチルアミノ基をもつ誘導体D-1と比較して，TICTの抑制により狙い通り蛍光量子収率・生物発光輝度共に向上することに成功した．

为了构建能够对身体深层成像的萤火虫生物发光系统，我们验证了通过关注发光反应中间体来提高发光亮度的可能性。尽管我们成功地提高了 ATP 及其衍生物的缩合物的亮度，但稳定性、纯化方法的建立和分离产率方面的问题也变得清晰起来。因此，我们决定尝试通过修改基板化学结构来实现更长的波长和亮度。作为开发指南，我们认为萤火虫生物发光底物是一种有机荧光染料，并模仿了有机荧光染料中的结构修饰技术。 1. 基于环融合策略创建近红外发射萤火虫荧光素衍生物近红外区域的光被认为是生物成像的理想选择，因为它较少受到水等生物分子的抑制。本研究在现有近红外衍生物的基础上，合成了总共六种含有环胺结构的衍生物NIRLucs。两者都被 Fluc（一种天然萤火虫荧光素酶）识别，并发出近红外光。此外，NIRLucs 被证实可渗透细胞膜，甚至在活细胞系统中也能发出近红外光。 NIRLuc2表现出良好的发光活性并在血液中保留，当将其应用于皮下荷瘤小鼠模型时，与天然底物相比，它表现出大约7倍的发光亮度（近红外区域的16倍）。 2.验证是否可以通过用环状氨基取代氮杂环丁烷来提高发光亮度使用萤火虫发光底物作为推挽型荧光染料，我们验证了是否可以通过抑制扭曲分子内电荷转移（TICT）来提高发光亮度。在本研究中，我们合成了总共五种在不同荧光素核心上引入氮杂环丁烷基的衍生物，并评估了氮杂环丁烷基取代对荧光素的影响。其中，与具有二甲氨基的衍生物D-1相比，导入了氮杂环丁烷基的A-1通过抑制TICT，如所期待地成功地提高了荧光量子收率和生物发光亮度。