動物個体内での可視化解析を目指した近赤外蛍光プローブの開発とその生物応用

开发用于个体动物可视化分析的近红外荧光探针及其生物学应用

基本信息

批准号：
14J12402
负责人：
沼澤宏治
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、フルオレセイン系の蛍光団を用いることで細胞膜上の葉酸受容体を選択的に検出できるプローブの開発に成功していたが、より生物応用に適した近赤外領域に蛍光を有する蛍光プローブの開発は達成できなかった。そこで本年度は、より実用的な葉酸受容体検出蛍光プローブを開発するため、新たに近赤外蛍光を有するSi-ローダミン類を用いて蛍光プローブを開発することを試み、近赤外蛍光を有し細胞膜上の葉酸受容体を選択的に可視化できる新規蛍光プローブFolateSiR-１を開発した。開発したプローブは、神経管閉鎖部において葉酸受容体の発現が認められているマウス胚や、葉酸受容体が過剰発現しているKB細胞を用いて作製した腫瘍モデルマウスを用いた動物実験に応用した。その結果、マウス胚においては神経管閉鎖部において強い蛍光集積が認められ、腫瘍モデルマウスの実験においては、腫瘍から強い蛍光が観察されたことから、新たに開発したプローブは動物個体の実験に使用可能なプローブであることが明らかとなった。特に腫瘍モデルマウスを用いた実験においては、プローブ投与後わずか30分という短いタイムスケールでS/N比高く腫瘍組織の可視化を達成しており、投与後数時間から1日かかる既存のプローブよりも優れた特性を持つ蛍光プローブの開発に成功した。また、本年度は動物個体への応用可能性を有する近赤外蛍光プローブとして、カルシウムイオン（Ca2+）をターゲットとするプローブの開発を行った。近赤外領域に蛍光波長を有し、生体内のカルシウムシグナリングに深く関与する細胞質内のCa2+を感度よく捉えることが可能な蛍光プローブはこれまでになかったが、本研究において初めて開発した。これを用いて、生細胞における外部刺激によるカルシウムオシレーションやラット脳スライスにおける神経発火現象の可視化を達成した。

到上一年，我们已经成功地开发了一种探针，该探针可以通过使用基于荧光素的荧光团选择性地检测细胞膜上的叶酸受体，但是我们无法实现近红外区域中荧光的荧光探针的开发，这些探针更适合生物学应用。因此，在今年，为了开发叶酸受体检测的更实用的荧光探针，我们试图使用具有近红外荧光的Si-rhodamines开发荧光探针，并开发了一种具有近红外荧光的新型荧光探针Folatesir-1，允许在细胞膜上选择叶酸受体在细胞膜上选择性地可视化。使用小鼠胚胎将开发的探针应用于动物实验，其中叶酸受体在神经管闭合中表达，并使用过表达叶酸受体的KB细胞产生的肿瘤模型小鼠。结果，在神经管闭合的小鼠胚胎中观察到强烈的荧光积累，并且在肿瘤模型实验的肿瘤模型中观察到了强荧光，这清楚地表明，新开发的探针是可以在动物个体实验中使用的探针。特别是，在使用肿瘤模型小鼠的实验中，在注射探针后仅30分钟的短时间内，在短时间内实现了肿瘤组织可视化，并且荧光探针成功地开发了具有比现有探针更高的荧光探针相比，该探针比现有探针较高，而现有探针则需要几个小时才能在给药后几个小时。此外，今年，我们开发了一种靶向钙离子（Ca2+）的探针作为近红外荧光探针，有可能应用于单个动物。从未有过荧光探针在近红外区域具有荧光波长，并且可以轻松捕获细胞质Ca2+，该细胞质Ca2+在体内深深涉及钙信号传导，但这是在本研究中首次进行的。使用它，我们在活细胞中实现了外部刺激，并在大鼠脑切片中可视化神经扰动现象。