動物個体内での可視化解析を目指した近赤外蛍光プローブの開発とその生物応用

开发用于个体动物可视化分析的近红外荧光探针及其生物学应用

基本信息

批准号：
14J12402
负责人：
沼澤宏治
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までに、フルオレセイン系の蛍光団を用いることで細胞膜上の葉酸受容体を選択的に検出できるプローブの開発に成功していたが、より生物応用に適した近赤外領域に蛍光を有する蛍光プローブの開発は達成できなかった。そこで本年度は、より実用的な葉酸受容体検出蛍光プローブを開発するため、新たに近赤外蛍光を有するSi-ローダミン類を用いて蛍光プローブを開発することを試み、近赤外蛍光を有し細胞膜上の葉酸受容体を選択的に可視化できる新規蛍光プローブFolateSiR-１を開発した。開発したプローブは、神経管閉鎖部において葉酸受容体の発現が認められているマウス胚や、葉酸受容体が過剰発現しているKB細胞を用いて作製した腫瘍モデルマウスを用いた動物実験に応用した。その結果、マウス胚においては神経管閉鎖部において強い蛍光集積が認められ、腫瘍モデルマウスの実験においては、腫瘍から強い蛍光が観察されたことから、新たに開発したプローブは動物個体の実験に使用可能なプローブであることが明らかとなった。特に腫瘍モデルマウスを用いた実験においては、プローブ投与後わずか30分という短いタイムスケールでS/N比高く腫瘍組織の可視化を達成しており、投与後数時間から1日かかる既存のプローブよりも優れた特性を持つ蛍光プローブの開発に成功した。また、本年度は動物個体への応用可能性を有する近赤外蛍光プローブとして、カルシウムイオン（Ca2+）をターゲットとするプローブの開発を行った。近赤外領域に蛍光波長を有し、生体内のカルシウムシグナリングに深く関与する細胞質内のCa2+を感度よく捉えることが可能な蛍光プローブはこれまでになかったが、本研究において初めて開発した。これを用いて、生細胞における外部刺激によるカルシウムオシレーションやラット脳スライスにおける神経発火現象の可視化を達成した。

直到前一年，我们才成功开发出一种可以使用基于荧光素的荧光团选择性检测细胞膜上叶酸受体的探针，但这种探针的荧光位于近红外区域，更适合生物荧光应用的开发。探针无法实现。因此，今年，为了开发更实用的检测叶酸受体的荧光探针，我们尝试利用具有近红外荧光的Si-rhodamins开发出一种新的荧光探针FolateSiR-1，可以选择性地可视化细胞膜上的叶酸受体。开发的探针将应用于使用小鼠胚胎的动物实验，其中在神经管闭合中观察到叶酸受体的表达，并且使用过度表达叶酸受体的KB细胞创建的肿瘤模型小鼠也观察到了叶酸受体的表达。结果，在小鼠胚胎的神经管闭合处观察到强荧光积累，并且在使用肿瘤模型小鼠的实验中从肿瘤观察到强荧光。新开发的探针用于个体动物实验已经清楚这一点。是一个可能的探针。特别是，在使用肿瘤模型小鼠的实验中，与现有探针在给药后需要数小时至一天的时间相比，我们在探针给药后仅30分钟的短时间内就实现了具有高信噪比的肿瘤组织的可视化。我们成功开发了具有优异性能的荧光探针。此外，今年我们开发了一种针对钙离子（Ca2+）的探针作为近红外荧光探针，有可能应用于个体动物。迄今为止，还没有一种荧光探针具有近红外区域的荧光波长，并且可以灵敏地捕获细胞质内的Ca2+，而细胞质内的Ca2+与生物体中的钙信号传导密切相关，但这项研究是首次开发出这种探针。利用这一点，我们成功地可视化了活细胞中外部刺激引起的钙振荡和大鼠脑切片中的神经放电现象。