精子先体反応における膜融合制御機構の解明

精子顶体反应中膜融合控制机制的阐明

基本信息

批准号：
19J12450
负责人：
諸星茜
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J12450/
关键词：
先体反応膜融合受精雄性生殖細胞ノックアウトマウス

项目摘要

精子の受精能獲得時に起こる先体反応では、精子頭部に存在する小胞 (先体) のエキソサイトーシスによりIZUMO1分子が露出し、受精可能となる。先体反応不全は不妊の原因の一つであると考えられており、先体反応の分子機構の解明は生物学・医学の双方の視点から重要である。しかしながら先体反応に必須な遺伝子は見つかっておらず、メカニズムも未解明である。申請者はノックアウトマウスを用いたスクリーニングにより、先体反応に関わる因子としてtFER1L3を新規に同定した。本研究ではtFER1L3の機能解析を通じ、先体反応のメカニズムを解明することを目的とした。そこで本年度は主に下記の2点について研究を遂行した。(1) 透過型電子顕微鏡を用いて精子の細胞膜/先体膜の観察を行った。従来法では、膜形態を保持しながら観察用のサンプルを調整することが困難であった。そのため今年度は、培養細胞で確立されている、サイトスピンを用いた方法について条件検討を行った。培養精子をサイトスピンを用いてカバーガラスに付着させ、固定・包埋することで、生細胞に近い膜構造を維持したサンプル作製に成功した。結果、tFer1l3欠損精子では先体反応直前に観察される、先体の膨らみは認められるものの膜の融合は起こらないことが明らかとなり、tFER1L3は膜融合のステップで機能することが示唆された。(2) tFER1L3の結合タンパク質を探索するために、tFER1L3のC末端にPAおよび1D4タグをタンデムに付加したタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製し、免疫沈降の条件を検討した。結果、PAタグ抗体が免疫沈降に有用であることを見出し、現在、質量分析等を用いた結合タンパク質の同定に向けて詳細な条件検討を行っている。

在获得精子受精时发生的ACROSOM反应中，精子头中存在的囊泡（Alphabos）的胞吐作用暴露了Izumo1分子，使得有可能受精。从生物学和医学的角度来看，ACROSOM体的反应失败被认为是不育的原因之一，阐明Adrosom反应的分子机制至关重要。然而，尚未发现缺乏基因的基因，并且尚未澄清机制。申请人通过使用基因敲除小鼠筛选，新确定的TFER1L3是参与Adrosom反应的因素。这项研究旨在通过TFER1L3的功能分析来阐明Adrosom反应的机制。因此，今年我们主要对以下两个点进行了研究：（1）使用透射电子显微镜观察到精子的细胞膜/Alpith膜。在常规方法中，很难在保留膜形态的同时准备样品进行观察。因此，今年我们研究了使用Cytospin的方法，该方法是在培养细胞中确定的。使用细胞纺丝和固定和嵌入将培养的精子连接到盖玻片上，从而成功制备了样品，该样品维持了与活细胞相似的膜结构。结果，很明显，在缺乏TFER1L3缺乏的精子中，在Adrosos反应之前观察到的Adrosos肿胀，但没有发生膜融合，这表明TFER1L3在膜融合步骤中起作用。（2）要搜索TFER1L3的结合蛋白，将表达蛋白质的转基因小鼠添加到TFER1L3的C末端，并检查了免疫沉淀的条件。结果，已经发现PA TAG抗体可用于免疫沉淀，目前正在经历详细条件，用于使用质谱法等鉴定结合蛋白。