遺伝学とケミカルバイオロジーの融合による植物オートファジーの分子理解と応用展開

通过遗传学和化学生物学的融合对植物自噬的分子理解和应用开发

基本信息

批准号：
19J01681
负责人：
中村咲耶
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者はこれまでに、太陽光に含まれる紫外線や強度の強い可視光 (強光) によって障害を受けた葉緑体が、丸ごと液胞内へと輸送・除去されるオートファジー経路「選択的クロロファジー」経路の存在を示した。本研究では、特に障害葉緑体を認識するレセプター機構について分子レベルでの理解を進めるために、植物遺伝学の手法を駆使する順遺伝学スクリーニングと、ケミカルバイオロジーの手法を取り入れるケミカルスクリーニングを行い、得られた結果に応じて両者を連携、補填しながら研究を進めた。順遺伝学スクリーニングでは、昨年度までの解析で得られたクロロファジー特異的変異株の原因遺伝子について、T-DNA挿入変異株やCRISPR/Cas9法による欠損株を複数整備し、クロロファジー活性への影響を試験し、同定した遺伝子がクロロファジー経路の過程で機能していることを確認した。これと並行して、原因遺伝子を対象に、蛍光タンパク質融合コンストラクトを作製し、植物体内での局在解析を行った。クロロファジー抑制化合物を単離するケミカルスクリーニングでは、昨年度までに単離した候補化合物を対象に濃度依存性の活性評価を行い、安定して抑制効果を示す化合物を28種類選抜することに成功した。特に、抑制効果の高い化合物について、その構造を基に類縁化合物を作製し、構造活性相関解析を行った。これにより、抑制活性に必要な構造を絞り込むことができた。

申请人先前已经证明了自噬途径的存在，即“选择性氯噬型”途径，其中紫外线受损的叶绿体和阳光中包含的强光（高光）受损的叶绿体被运输并完全去除液泡中。在这项研究中，为了促进对识别分子水平上无序叶绿体的受体机制的理解，我们使用植物遗传技术和化学筛选进行了融合化学生物学技术的植物遗传筛查。根据获得的结果，我们在协作和补充两者的同时进行了研究。在正向遗传学筛选中，我们使用CRISPR/CAS9方法开发了多个T-DNA插入突变体和有缺陷的菌株，用于在分析中获得的氯磷特异性突变体的致命基因，直到去年为止，并测试了它们对氯磷活性的影响，从而确保了该鉴定的基因在氯脂途径的过程中起作用。同时，为致病基因制备了荧光蛋白融合构建体，并在植物中进行了定位分析。在化学筛选以分离氯磷酸抑制剂时，我们对直到去年分离的候选化合物进行了浓度依赖性活性评估，并成功选择了28种表现出稳定抑制作用的化合物。特别是，对于具有较高抑制作用的化合物，根据化合物的结构制备了类似的化合物，并进行了结构活性相关分析。这允许缩小抑制活性所需的结构。