指向性進化を用いた芳香族ポリマー原料生合成経路の構築

利用定向进化构建芳香族聚合物原料生物合成途径

基本信息

批准号：
20J12216
负责人：
小川友希
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではエンジニアリングプラスチックの原料である2,6-xylenolの人工生合成経路の構築を目指した。2,6-xylenolは酸化酵素XylMABCによってわずかに、転写制御因子XylSが認識する3-メチルサリチル酸に変換されるため、XylSによる検出が可能である。そこで、XylSを利用してXylMABCを改変することで、2,6-xylenolから3-メチルサリチル酸への変換効率を向上させ、より高感度な2,6-xylenol検出系の構築に取り組んだ。まず、XylSの制御下に抗生物質耐性遺伝子や蛍光タンパク質遺伝子を配置した遺伝子モチーフを利用して、3-メチルサリチル酸の生産量から変異型XylMの活性を評価する系を構築した。この評価系を用いて変異型XylM活性を評価し、機械学習と組み合わせることで、XylMの指向性進化を行った。これにより変換効率が野生型の20倍に向上した変異型XylMの取得に成功した。転写制御因子による酵素活性の評価系を、機械学習と組み合わせた酵素改変手法はこれまで確立されていなく、本研究で確立した手法は膜タンパク質などのin vitroでの酵素活性評価が困難なタンパク質のように、機械学習の適用が難しいと考えられてきたタンパク質の改変を可能にする先駆的な手法である。また3,5-ジメチルチロシンから2,6-xylenolへの変換を担う変異型TPLを構築し、2,6-xylenol人工生合成経路の下流経路の反応が進行することを実証した。そこで、変異型TPL、変異型XylM、XylABC、XylSを組み合わせた3,5-ジメチルチロシン生産検出システムを利用し、2,6-xylenol人工生合成経路の上流経路の反応を担うメチル基転移酵素SacFの活性評価システムを構築した。今後この系を用いてSacFの改変が可能になることが期待できる。

在本研究中，我们旨在构建工程塑料原料2,6-二甲酚的人工生物合成途径。 2,6-二甲苯酚被氧化酶XylMABC轻微转化为3-甲基水杨酸，被转录调节因子XylS识别，因此可以被XylS检测到。因此，通过使用XylS修饰XylMABC，提高了2,6-二甲苯酚向3-甲基水杨酸的转化效率，并致力于构建更灵敏的2,6-二甲苯酚检测系统。首先，我们构建了一个系统，根据产生的3-甲基水杨酸的量来评估突变体XylM的活性，使用的基因基序将抗生素抗性基因和荧光蛋白基因置于XylS的控制之下。使用该评估系统，我们评估了突变体XylM的活性，并将其与机器学习相结合，以进行XylM的定向进化。结果，我们成功获得了转化效率比野生型高20倍的突变体XylM。迄今为止，尚未建立将使用转录调节因子的酶活性评估系统与机器学习相结合的酶修饰方法，本研究建立的方法适用于膜蛋白等体外酶活性评估困难的蛋白质。这是一种开创性的方法，可以对蛋白质进行修饰，而此前人们认为蛋白质很难应用机器学习。我们还构建了负责将3,5-二甲基酪氨酸转化为2,6-二甲酚的突变TPL，并证明2,6-二甲酚人工生物合成途径下游途径的反应得以进行。因此，我们采用了结合突变体TPL、突变体XylM、XylABC的3,5-二甲基酪氨酸产生检测系统，并构建了活性评价系统。预计将来可以使用该系统修改SacF。