抗転移細胞で特異的に発現するタンパク質の分子機序解明

阐明抗转移细胞中特异性表达的蛋白质的分子机制

• 批准号: 20K06554
• 负责人: 富田 毅
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06554/
• 关键词: 細胞外RNA; タンパク質間相互作用; タンパク質核酸相互作用; プルダウンアッセイ; 抗転移細胞

ヒトZC3Hタンパク質には58kDaアイソフォームと36kDaアイソフォームの２種類のアイソフォームが存在する。このうち、36kDaアイソフォームは293T細胞での過剰発現系構築および、細胞抽出液からの目的タンパク質精製が比較的容易である。例えば、精製タンパク質を用いたEMSAによる核酸結合アッセイを行うためには、36kDaアイソフォームの場合、10cmディッシュ20枚の293T細胞で可能であるのに対し、58kDaアイソフォームの場合は10cmディッシュ100枚の細胞が必要である。これまでの研究はすべて、36kDaアイソフォームでデータを取得してきた。しかし、実際に生体内で機能しているのは58kDaアイソフォームであるので、ZC3Hタンパク質の機能実験は58kDaアイソフォームで確認しなければならない。ZCタンパク質と結合するタンパク質との相互作用には、58kDaアイソフォーム特異的配列が関与しているとされている。本年度は、58kDaアイソフォームを精製し、IL1bRNAとの結合をEMSAで確認した。さらに蛍光相関分光法(FCS)およびゲルろ過によるタンパク質-RNA結合の検討を行うために58kDaアイソフォームの精製を行っている。精製の第一段階である、タグ抗体カラムによる精製を、これまでに何度か行っているが、精製タンパク質が全く得られないという事象が発生しており、問題となっている。現在、安定的に精製タンパク質を得るためのトラブルシューティングを行っている。ゲルろ過カラムは、高分子の分離に適用できるものがなかったため、新たに導入することとした。

人类 ZC3H 蛋白有两种亚型：58kDa 亚型和 36kDa 亚型。其中，36kDa亚型相对容易在293T细胞中构建过表达系统并从细胞提取物中纯化目标蛋白。例如，要使用纯化的蛋白质通过 EMSA 进行核酸结合测定，36kDa 同工型需要 20 个 10cm 培养皿的 293T 细胞，而 58kDa 同工型则需要 100 个 10cm 培养皿。之前的所有研究都获得了 36kDa 同工型的数据。然而，由于58kDa亚型实际上在体内发挥作用，因此必须使用58kDa亚型来确认ZC3H蛋白的功能实验。据说 58kDa 异构体特异性序列参与 ZC 蛋白和结合蛋白之间的相互作用。今年，我们纯化了58kDa同工型，并通过EMSA证实了其与IL1bRNA的结合。此外，我们正在纯化 58kDa 同工型，以通过荧光相关光谱 (FCS) 和凝胶过滤研究蛋白质-RNA 结合。使用标签抗体柱的第一步纯化已经进行了数次，但也曾发生过无法获得纯化蛋白的情况，这已成为一个问题。我们目前正在排除故障，以稳定获得纯化的蛋白质。由于没有可以应用于聚合物分离的凝胶过滤柱，我们决定引入一种新的凝胶过滤柱。

项目成果

転移前土壌の消失をめざして

旨在消除过渡前土壤

• 发表时间: 2021
• 作者: 平塚佐千枝;富田 毅
• 通讯作者: 富田 毅