Xist RNA dynamics in living cells

Xist 活细胞中的 RNA 动力学

• 批准号: 20K06484
• 负责人: 佐藤 優子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06484/
• 关键词: クロマチン; エピジェネティクス; ライブイメージング; 長鎖ノンコーディングRNA; X染色体不活性化; Xist; XCI; RNA; Live cell imaging; Chromatin

2022年度は、クロマチン動態とヒストン修飾の関係に注目して解析を進めた。本研究ではこれまで、X染色体上の特定の遺伝子領域について、gRNA/dCas9システムを用いて、生細胞内動態（Mean square displacement: MSD）を調べてきた。X染色体不活性化により不活性化されたX染色体では、活性化X染色体上のDNA領域よりも動きが拘束されていた。動態を調べた3か所のDNA領域のうちの1か所は、不活性化X染色体上で転写が活性化されているXist遺伝子近傍にあり、転写阻害剤の添加により動態の拘束が緩和された。したがって転写されている領域では、転写活性化によりクロマチン動態が拘束されていることが示唆された。今年度は、ヒストン修飾のクロマチン動態への影響について、修飾酵素阻害剤の添加により調べた。不活性化X染色体に高度に蓄積されている抑制性ヒストン修飾H3K27me3を除去するため、責任酵素であるEzh1/2阻害剤（DS-3201）を添加して4日間培養した。この処理によりH3K27me3は検出できないレベルまで低下させて、前年度と同様にgRNA/dCas9システムによるDNA領域の動態観察を行った。その結果、H3K27me3を除去した場合でも、不活性X染色体上のDNA領域の動態は拘束されており、変化はほとんど見られなかった。そこで次に、ユークロマチンドメインとヘテロクロマチンドメインの可視化を行い、動態を調べることにした。今年度はクロマチンドメインのライブイメージングを行うための実験系を樹立した。H3K9ac-mintbodyとH3K27me3-mintbodyをHeLa細胞に発現させて、超解像度蛍光顕微鏡を用いてライブイメージングにより検出した。H3K9ac-mintbodyは細胞内安定性が十分ではなかったため、アミノ酸置換による改良を行った。

在2022年，进行了分析，重点是染色质动力学和组蛋白修饰之间的关系。在这项研究中，我们先前使用GRNA/DCAS9系统研究了X染色体上特定基因区域的均方根位移（MSD）。 X染色体灭活灭活的X染色体比活化X染色体上的DNA区域具有更大的约束。检查动力学的三个DNA区域之一位于Xist基因附近，该基因在灭活的X染色体上被激活，而添加转录抑制剂可以缓解动力学约束。因此，建议染色质动力学受到转录区域中转录激活的约束。今年，通过添加改良的酶抑制剂研究了组蛋白修饰对染色质动力学的影响。为了去除灭活的X染色体上高度积累的抑制性组蛋白改性的H3K27me3，加入了负责的酶EZH1/2抑制剂（DS-3201）并培养4天。这种治疗将H3K27ME3降低至无法检测到的水平，并且与上一年一样，使用GRNA/DCAS9系统观察到DNA区域的动力学。结果，即使去除了H3K27me3，也限制了非活动X染色体上DNA区域的动力学，几乎没有变化。因此，我们接下来决定可视化构素蛋白结构域和异染色质结构域以检查动力学。今年，我们建立了一个实验系统，用于染色质结构域的实时成像。 H3K9AC-MINT体和H3K27me3-Mintbody在HeLa细胞中表达，并使用超分辨率的荧光显微镜通过实时成像检测。由于H3K9AC-MINT体不足以细胞内稳定性，因此可以通过氨基酸取代进行改进。

项目成果

生細胞プローブを用いた不活性化X染色体動態と転写制御の解析

使用活细胞探针分析失活 X 染色体动力学和转录调控

• 发表时间: 2021
• 作者: 20.佐藤優子;内野哲志;伊藤由馬;前原一満;大川恭行;徳永万喜洋;木村宏
• 通讯作者: 木村宏

Live imaging of transcription sites using an elongating RNA polymerase II-specific probe.

• DOI: 10.1083/jcb.202104134
• 发表时间: 2022-02-07
• 期刊: The Journal of cell biology
• 作者: Uchino S;Ito Y;Sato Y;Handa T;Ohkawa Y;Tokunaga M;Kimura H
• 通讯作者: Kimura H

Visualizing transcription sites in living cells using a genetically encoded probe specific for the elongating form of RNA polymerase II

• DOI: 10.1101/2021.04.27.441582
• 发表时间: 2021-04
• 期刊: bioRxiv
• 作者: Satoshi Uchino;Yuma Ito;Y. Sato;Tetsuya Handa;Y. Ohkawa;M. Tokunaga;H. Kimura

Multiplexed Imaging of Posttranslational Modifications of Endogenous Proteins in Live Cells

活细胞内源蛋白翻译后修饰的多重成像

• DOI: 10.1007/978-1-0716-1593-5_3
• 发表时间: 2021
• 期刊: Methods in Molecular Biology
• 作者: Sato Yuko;Kimura Hiroshi
• 通讯作者: Kimura Hiroshi

Imaging transcription elongation dynamics by new technologies unveils the organization of initiation and elongation in transcription factories

通过新技术对转录延伸动态进行成像揭示了转录工厂中起始和延伸的组织

• DOI: 10.1016/j.ceb.2022.01.002
• 发表时间: 2022
• 期刊: Current Opinion in Cell Biology
• 影响因子: 7.5
• 作者: Kimura Hiroshi;Sato Yuko
• 通讯作者: Sato Yuko