生物時計が調節する魚類の免疫リズムの解明～感染症の防除を目指して～

阐明生物钟调节的鱼类免疫节律 - 旨在控制传染病 -

基本信息

批准号：
20H03064
负责人：
河野智哉
金额：
$ 11.4万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03064/
关键词：
魚類免疫感染症概日リズム時計遺伝子免疫関連遺伝子

项目摘要

ゲノム編集技術CRISPR / Cas9システムを用いて、時計遺伝子Bmal1およびRORaノックアウト(KO)メダカの作出を試みた。Bmal1-KOメダカの作出においては、ホモ変異個体(F4)の作出に成功した。さらにBmal1-KOメダカの行動を野生型 (WT) メダカと比較したところ、WTメダカの遊泳が緩慢になる夜間 (暗闇) において、KOメダカは活発な遊泳を見せた。また、受精卵から仔魚の発生までにかかる日数がWTと比べBmal1-KOメダカは長いことが分かった。これらは、生理機構のリズムを司る時計遺伝子の破壊による表現型であると考えられる。RORa-KOメダカの作出においては、F3ホモ個体を得るところまでは順調に進んだが、ホモ個体の掛け合わせでは産卵が進まなくなったため、ホモ個体とヘテロ個体を掛け合わせることでホモ個体の増産を進めた。今後はWTとKOメダカにおける発現遺伝子の違いを詳細に検討する予定である。続いて、異なる時刻での病原体感染に対する生体防御能について検討した。LD12:12に馴致したWTメダカを1.0 x 10^5 CFU/ml濃度の病原細菌(Edwardsiella piscicida)液で2時間浸漬感染し、その後の斃死率および体内での菌数変化を調べた。その結果、ZT2感染区における死亡率はZT14感染区と比べ有意に低く、また体内で増殖した細菌数も有意に少ないことが確認された。さらに、ZT2感染区における炎症性サイトカイン (il1b, il6, il8) およびToll様受容体 (tlr5m) の発現はZT14感染区と比べ顕著に増加した。これらのことから、病原体に対する生体防御能は時刻によって異なることが示唆された。

我们尝试利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统创建时钟基因Bmal1和RORa敲除（KO）青鳉。在Bmal1-KO青鳉的生产中，我们成功创建了纯合突变体（F4）。此外，当我们将 Bmal1-KO 青鳉的行为与野生型（WT）青鳉的行为进行比较时，我们发现 KO 青鳉在夜间（黑暗）表现出活跃的游泳，而 WT 青鳉则缓慢游动。此外，还发现Bmal1-KO青鳉中从受精卵发育成幼虫所需的天数比WT中更长。这些被认为是由控制生理机制节律的时钟基因破坏引起的表型。在RORa-KO青鳉的生产中，我们进展顺利，获得了F3纯合个体，但当我们使纯合个体杂交时，产卵并没有进展，因此我们继续通过纯合个体和杂合个体的杂交来增加纯合个体的产量塔。未来，我们计划详细研究WT和KO青鳉之间表达基因的差异。接下来，我们检查了不同时间针对病原体感染的生物防御能力。将适应LD12:12的WT青鳉鱼浸入浓度为1.0 x 10^5 CFU/ml的病原菌（Edwardsiella piscicida）溶液中感染2小时，观察随后的死亡率和鱼体中细菌数量的变化。尸体被调查。结果证实，ZT2感染区的死亡率明显低于ZT14感染区，体内增殖的细菌数量也明显较低。此外，与ZT14感染区域相比，ZT2感染区域中炎症细胞因子（il1b、il6、il8）和Toll样受体（tlr5m）的表达显着增加。这些结果表明，身体防御病原体的能力因一天中的不同时间而异。