Efficient production of CD46 knockout pigs by using adeno-associated virus vectors carrying the CRISPR / Cas9 system

利用携带CRISPR/Cas9系统的腺相关病毒载体高效生产CD46基因敲除猪

基本信息

批准号：
20K06440
负责人：
渡部聡
金额：
$ 1.75万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者は、アデノ随伴ウイルスに黄色ブドウ球菌由来のCas9(saCas9)遺伝子とガイドRNA遺伝子を搭載したベクター(AAV-CRISPR)を作成し、ブタで豚コレラウイルス(SFV)受容体で免疫系細胞の表面に存在するCD46タンパクの遺伝子をノックアウトし、SFVに感染しないブタを作製する研究に着手した。令和2年度は、saCas9が哺乳類細胞で機能するか確認するため、マウスチロシナーゼ遺伝子に対するgRNAとsaCas9遺伝子を搭載したAAV-CRISPRを、マウス黒色腫に感染させる実験を行った。その結果、メラニン合成が減少し細胞色が白色となりウエスタンブロッティングでもチロシナーゼ産生が著しく減少することを確認した。この結果から、saCas9は哺乳類細胞でも機能することを確認した。また、EGFP遺伝子を搭載したAAVをマウス受精卵にin vitroで感染させたところ、これらの受精卵は緑色の蛍光を発しAAVが哺乳類の受精卵に感染できることが明らかになった。また、これまでブタのCD46と反応する抗体はなく、このタンパクの存在や動態を確認できなかった。そこで我々は、SFVのキャプシッドタンパク遺伝子の中でCD46に結合するE2領域とEGFP遺伝子の融合合成遺伝子を作成しこれを培養細胞で発現させ、融合タンパクを作らせて精製しCD46の存在を調べる方法を考案した。E2-EGFP遺伝子を293T細胞に導入したところ、その培養上清から強い蛍光を発するタンパクのフラクションを得られた。このタンパクを、ブタ胸腺から採取した初代培養細胞に反応させたところ、細胞表面に蛍光を示す細胞が観察されE2-EGFP融合タンパクが免疫系の細胞表面に存在するCD46と結合することが示唆された。今後これらのツールを使用して研究を推進していく予定であったが異動となり、本課題を中止することとなった。

申请人创建了一个载有依赖腺相关病毒的载体（AAV-CRISPR），该病毒衍生自Cas9（SACAS9）基因和引导RNA基因（AAV-CRISPR），并敲除了在猪中受到猪（SFV）的受体研究的猪的表面上发现的CD46蛋白的基因，并从事SFV病毒（SFV）的受体，并研究了SF。在2020年，为了确认SACAS9是否在哺乳动物细胞中起作用，我们在用GRNA感染小鼠黑色素瘤的鼠酪氨酸酶基因和携带SACAS9基因的AAV-CRISPR方面进行了实验。结果，黑色素合成降低，细胞颜色变为白色，即使在蛋白质印迹中，酪氨酸酶的产生也会显着降低。从这些结果中可以证实，SACAS9在哺乳动物细胞中也起作用。此外，当小鼠受精卵在体外用携带EGFP基因的AAV感染时，这些受精卵会发出绿色荧光，表明AAV可以感染哺乳动物受精卵。此外，到目前为止，还没有与PIG CD46反应抗体，并且无法证实该蛋白质的存在或动力学。因此，我们设计了一种方法，在这种方法中，E2区域的融合合成基因与CD46结合，EGFP基因在SFV的衣壳蛋白基因中产生，并在培养的细胞中表达，产生，纯化，纯化，并研究了CD46的存在。当将E2-EGFP基因引入293T细胞中时，从培养物上清液中获得了发射强荧光的蛋白质的一部分。当该蛋白与从猪胸腺收集的原代培养细胞反应时，在细胞表面表现出荧光的细胞表明E2-EGFP融合蛋白与CD46结合，CD46存在于免疫系统的细胞表面上。我们计划使用这些工具来促进研究，但是我们被转移了，这项任务被取消了。