ブタ脂肪前駆細胞におけるゲノム編集を用いた細胞分化制御メカニズムの解析

猪前脂肪细胞基因组编辑分析细胞分化控制机制

• 批准号: 26450454
• 负责人: 渡部 聡
• 金额: $ 3.24万
• 依托单位: National Institute of Agrobiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26450454/
• 关键词: ゲノム編集; EndoGalC; target toxin; 細胞選択法

近年、ゲノム編集技術が開発され、遺伝子改変を容易に行うことが可能になった。しかし、従来のノックアウト法とは異なりゲノム編集では薬剤耐性遺伝子を用いないため、遺伝子改変が起こった細胞を選択するために多大な手間と時間を要していた。そのため効率の良い新たな選択方法が求められていた。一方、新世界ザルより下等な生物は全て細胞表面にαGal抗原(Galα1-3Gal-R)という糖鎖構造を持つ。この糖鎖構造はBS-IB4というレクチンによって特異的に認識される。また、このレクチンにタンパク合成を阻害する毒素であるサポリンを結合させたIB4-SAPを動物細胞に作用させると、この物質が結合した細胞に細胞死を起こす。その濃度は0.4-1.0 μg/mlと極めて低濃度であり処理時間も30分間で十分である。また、Endo-β-galactosidase C (EndoGalC)はウェルシュ菌から単離されαGal抗原を特異的に切断する酵素である。この酵素遺伝子を動物細胞で発現させると細胞表面のαGal抗原を除去することができ、IB4-SAP処理による細胞死を回避できる。そこで、EndoGalC発現ベクターをhCas9発現ベクター、gRNA発現ベクターと細胞に共導入し、IB4-SAP処理を行うことで遺伝子改変細胞を濃縮する方法を開発した。これまでに、ブタ胎児繊維芽細胞、ブタ脂肪前駆細胞、マウス繊維芽細胞、マウスES細胞など、生物・細胞種を問わず遺伝子改変細胞の濃縮が確認でき、単離された細胞の約10％がbi-allelicなノックアウトであることが確認された。これらより、EndoGalCとIB4-SAPの組み合わせはCRISPRにおける遺伝子改変細胞の濃縮方法として非常に有効であることが示された。

近年来，基因组编辑技术得到发展，使得基因编辑变得容易。然而，与传统的敲除方法不同，基因组编辑不使用耐药基因，因此需要花费大量的精力和时间来选择经过基因改造的细胞。因此，需要一种新的、有效的选择方法。另一方面，新世界猴以下的所有生物的细胞表面都具有称为αGal抗原（Galα1-3Gal-R）的糖链结构。这种糖链结构被称为 BS-IB4 的凝集素特异性识别。此外，IB4-SAP（一种与皂草素（一种抑制蛋白质合成的毒素）结合的凝集素）应用于动物细胞时，该物质会导致结合细胞的细胞死亡。其浓度极低，为0.4-1.0μg/ml，处理时间30分钟就足够了。此外，Endo-β-半乳糖苷酶 C (EndoGalC) 是一种从产气荚膜梭菌中分离出来的酶，可特异性切割 αGal 抗原。当该酶基因在动物细胞中表达时，可以去除细胞表面的αGal抗原，避免IB4-SAP处理引起的细胞死亡。因此，我们开发了一种富集转基因细胞的方法，将EndoGalC表达载体与hCas9表达载体和gRNA表达载体共同引入细胞中，并进行IB4-SAP处理。到目前为止，我们已经确认了转基因细胞的富集，无论生物体或细胞类型如何，例如胎猪成纤维细胞、猪前脂肪细胞、小鼠成纤维细胞和小鼠ES细胞，约占分离细胞的10%。双等位基因敲除。这些结果表明，EndoGalC 和 IB4-SAP 的组合作为使用 CRISPR 富集转基因细胞的方法非常有效。

项目成果

Direct Injection of CRISPR/Cas9-Related mRNA into Cytoplasm of Parthenogenetically Activated Porcine Oocytes Causes Frequent Mosaicism for Indel Mutations.

• DOI: 10.3390/ijms160817838
• 发表时间: 2015-08-03
• 期刊: International journal of molecular sciences
• 影响因子: 5.6
• 作者: Sato M;Koriyama M;Watanabe S;Ohtsuka M;Sakurai T;Inada E;Saitoh I;Nakamura S;Miyoshi K
• 通讯作者: Miyoshi K

A combination of targeted toxin technology and the piggyBac-mediated gene transfer system enables efficient isolation of stable transfectants in nonhuman mammalian cells

• DOI: 10.1002/biot.201400283
• 发表时间: 2015-01-01
• 期刊: BIOTECHNOLOGY JOURNAL
• 影响因子: 4.7
• 作者: Sato, Masahiro;Inada, Emi;Watanabe, Satoshi
• 通讯作者: Watanabe, Satoshi

EndGalCとIB4-SAPの組み合わせを用いたCRISPR遺伝子による遺伝子改変細胞濃縮法の開発

结合 EndGalC 和 IB4-SAP 开发使用 CRISPR 基因富集转基因细胞的方法

• 发表时间: 2014
• 作者: 渡部 聡;桜井敬之;中村伸吾;梶原景正;木村 穣;佐藤正宏
• 通讯作者: 佐藤正宏