酵母の呼吸代謝から発酵への転換におけるグルコース不活性化の総合理解

全面了解酵母从呼吸代谢到发酵过程中的葡萄糖失活

基本信息

批准号：
20H02894
负责人：
新谷尚弘
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

酵母Saccharomyces cerevisiaeでは培養液中の発酵性炭素源（グルコースなど）が枯渇すると、非発酵性炭素源を利用するための糖新生関連遺伝子群の発現が誘導される。この遺伝子発現にはマスターレギュレーターとして転写因子Cat8が関わっている。Cat8の支配下で発現する遺伝子のうち、JEN1に加えてSTL1遺伝子産物が培地へのグルコース添加に応答して不活性化（分解）を受けることが明らかになった。STL1はグリセロール輸送体をコードしている。Stl1はJen1と同様にRsp5-Rod1依存的に分解され、Stl1のC末端領域が分解に重要であることが分かった。そこで、さらにRsp5-Rod1による認識に重要なアミノ酸配列を解析し、ユビキチン化に重要なリシン残基の周辺配列の配列の重要性が示され、Jen1とStl1の分解機構の類似性が示唆された。そこで、Rsp5-Rod1依存的に分解されることが知られているガラクトース輸送体Gal2の分解機構を解析し、分解機構の比較解析を行った。Gal2はJen1やStl1と同様に１２回膜貫通領域を持つ膜タンパク質であるが、Jen1やStl1とは異なりN末端領域にRsp5-Rod1によって認識される領域があることが示唆された。また、Jen1の認識において、Rod1側の基質認識ドメインを調査するための評価系を確立した。前年度までに、Cat8自身もグルコースに応答して分解されることを明らかにしていた。プロテアソーム阻害剤で分解が阻害されることから、ユビキチンープロテアソーム系の関与が示唆された。そこで、選択的ユビキチン化にかかわるとされるユビキチンリガーゼの同定を目指した。すなわち、ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子の破壊株ライブラリーを入手し、それら破壊株におけるCat8の分解を網羅的に解析した。

在酿酒酵母中，当培养基中的可发酵碳源（例如葡萄糖）耗尽时，糖异生相关基因的表达被诱导以利用不可发酵碳源。转录因子 Cat8 作为该基因表达的主调节因子。在 Cat8 控制下表达的基因中，除了 JEN1 之外，还发现 STL1 基因产物响应培养基中添加的葡萄糖而失活（降解）。 STL1 编码甘油转运蛋白。与 Jen1 一样，Stl1 以 Rsp5-Rod1 依赖性方式降解，并且发现 Stl1 的 C 末端区域对于降解很重要。因此，我们进一步分析了对 Rsp5-Rod1 识别重要的氨基酸序列，并证明了赖氨酸残基周围序列的重要性，这对泛素化很重要，表明 Jen1 和 Stl1 降解机制的相似性。因此，我们分析了已知以Rsp5-Rod1依赖性方式降解的半乳糖转运蛋白Gal2的降解机制，并对降解机制进行了比较分析。 Gal2与Jen1和Stl1一样，是具有12次跨膜区域的膜蛋白，但与Jen1和Stl1不同的是，有人认为它的N末端区域具有被Rsp5-Rod1识别的区域。此外，我们建立了一个评估体系来研究Jen1识别中Rod1的底物识别域。到了去年，已有研究表明 Cat8 本身会响应葡萄糖而降解。由于降解被蛋白酶体抑制剂抑制，因此表明泛素-蛋白酶体系统参与其中。因此，我们的目的是鉴定一种被认为参与选择性泛素化的泛素连接酶。具体来说，我们获得了泛素连接酶编码基因被破坏的菌株文库，并全面分析了这些被破坏的菌株中Cat8的降解情况。