ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリング

基于基因组编辑的巨型酶的功能分析与工程

基本信息

批准号：
20J20880
负责人：
瀧野純矢
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題は、ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリングを目的として研究を進めている。昨年度までに、ゲノム編集による麹菌ホットスポットへの遺伝子導入によって、繰り返し型ポリケタイド合成酵素 (HR-PKS)の網羅的解析を行い、立体制御の一般的な規則を提唱した。本年度は、HR-PKSによる骨格形成以降の反応に焦点をあて、酸無水物二量体ホモイドライドB生合成を研究対象として、構造多様性創出に寄与する酵素遺伝子の探索を行った。ホモイドライドBはコレステロール値低下作用を示す糸状菌由来天然物であり、無水マレイン型モノマーが二量化した構造を有する。糸状菌は同様のモノマーによって合成される酸無水物二量体を多数生産するが、ホモイドライドBは他の類縁体には見られない特徴的なカゴ型構造を有している。本年度は、カゴ型構造形成機構を明らかにし、ポリケタイド系天然物の構造多様性創出の鍵となる酵素の探索を行った。以前に構築していた骨格構造生産麹菌に対して、生合成遺伝子クラスター中の機能未解析遺伝子4種の追加導入を行った結果、最終産物ホモイドライドBを観測することに成功した。次いで、ゲノム編集による迅速な機能解析によって、導入遺伝子の組み合わせを変えた形質転換体を作製することで、メチル基転移酵素がカゴ型構造形成の鍵酵素であることを明らかにした。本酵素の反応機構を詳細に解析する為、大腸菌により組換えタンパク質を調製し、補酵素の有無、阻害剤の添加、メチル化副生成物の構造決定によって、SAM依存的メチル化を起点としたアセタール形成によって、カゴ型構造が構築されることを明らかにした。この機構は初の解析例であることに加え、TstEホモログが類縁PKSクラスターでも観測されたことから、同様のカゴ型構造を有する天然物探索にも展開できると考えられる。

基于基因组编辑的巨型酶的功能分析和工程的目的是进行该研究主题。直到去年，通过基因组编辑的基因转移到Koji模具热点中，对重复的聚酮合酶（HR-PK）进行了全面分析，并提出了立体调节的一般规则。今年，我们专注于HR-PK形成骨骼结构后的反应，并研究了有助于创造结构多样性作为研究目标的酶基因。 HOMOIDLIDE B是一种自然产物，它源自丝状真菌，表现出降低胆固醇的作用，并具有一种结构，在该结构中，无水雄性型单体单体被二聚体。尽管丝状真菌产生许多由类似单体合成的酸赤道二聚体，但在其他类似物中却没有发现独特的篮子形结构。今年，我们发现了形成篮子形结构和探索酶的机制，这些酶是基于聚酮化合物的天然产物创建结构多样性的关键的酶。由于添加了四个尚未在生物合成基因簇中尚未在功能上分析的基因，以前构建的骨骼结构产生的骨骼结构产生了Koji霉菌，我们成功地通过使用基因组编辑的快速功能分析来观察最终的产品homoidlideB。接下来，使用基因组进行快速功能分析，以甲基蛋白的形成酶启示，以甲基化的形式组合，以甲基化的形式组合，以甲基化的形式组合，以甲基化的组合形成，并将其组合在一起。结构。为了详细分析该酶的机制，使用大肠杆菌和确定辅酶的存在或不存在，添加抑制剂以及甲基化副产物的结构来制备重组蛋白，从而揭示了篮形结构是通过从SAM依赖性依赖性甲基化甲基化的乙酰形结构来构建的。该机制不仅是第一个分析示例，而且在相关的PKS簇中观察到了TSTE同源物，因此可以认为它可以通过寻找具有相似篮子形结构的天然产品来开发。