Cryo-EMを用いる生体環境におけるβ2ミクログロブリン線維形成機構の解明

使用 Cryo-EM 阐明生物环境中 β2 微球蛋白原纤维形成机制

• 批准号: 20J10085
• 负责人: 張 春明
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University (2021)Osaka University (2020)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J10085/
• 关键词: 膜蛋白質複合体; 発現・精製; Cryo-EM; 単粒子構造解析; 破傷風毒素; グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素; 結晶構造解析; 溶液構造解析; 低温電子顕微鏡法解析

これまでに、私はミトコンドリアと小胞体の膜接触サイト(ERMES)複合体のCryo-EM構造解析を研究活動の中心に据え、チャレンジしてきた。先ず、構築できた高発現株を用いて、ERMES複合体の大量培養・高純度でのアフィニティ精製に成功した。収量は約7 mg/ml、100 μlだった。次に、精製できた複合体を用いて、Cryo-EM グリッドを作成し、Talos Arctica（東大・吉川研）で界面活性剤 (Digitonin と GDN)、サンプル濃度 (5～20 mg/mL)とグリッド (Au and Cu/Rh)の検討を行った。グリッドをスクリーニングした結果、低濃度より高濃度、Cu/RhよりAu、DigitoninよりGDNの方が単分散性と角分布のよい粒子（ミセル-蛋白質複合体）が観察された。そして、Krios G3i_Serial EM を用いて、ERMES複合体の電顕画像を収集し、所属研究室に導入・整備されているCryo-EM workstation を用いて、Relionなどの解析ツールで、単粒子構造解析を行った。また、ERMESの構成サブユニットであるMmm1の膜貫通（TM）領域で小胞体膜に結合，Mmm2-Mdm10によりミトコンドリア膜に結合しているので、Mmm1のTM領域をプロテアーゼで切り除くことによって、ERMES複合体の可溶性が高まり凝集が抑えられる、ナノディスクなどへの再構成が容易になることが期待できるため、(TMΔ-Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]或いは(GFP_TM-3C_Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]株の構築・発現を検討している。

迄今为止，我一直在研究我的研究活动的核心，对线粒体和内质网膜接触位点（ERMES）复合物进行了冷冻EM结构分析的挑战。首先，我们使用构造的高度表达菌株成功培养了大量的ERMES复合物，并在高纯度中纯化。产量约为7 mg/ml和100μl。接下来，使用纯化的复合物，制备冷冻EM网格，并通过Talos Arctica（Tokyo University Yoshikawa Institute）检查了表面活性剂（Digitonin和GDN），样品浓度（5-20​​ mg/ml）和网格（AU和CU/RH）。由于筛选网格，浓度高于低浓度的颗粒（胶束 - 蛋白质复合物），AU比CU/RH，而GDN具有更好的单分散性和更好的角度分布。然后，使用KRIOS G3I_SERIAL EM，收集了ERMES复合物的电子显微镜图像，并使用分析工具（例如使用Cryo-EM WorkStation依赖）进行了单个粒子结构分析，该工具已在实验室中引入和维持。 Furthermore, since Mmm1, a constituent subunit of ERMES, is bound to the endoplasmic reticulum membrane in the transmembrane (TM) region of Mmm1, and Mmm2-Mdm10 is bound to the mitochondrial membrane, by cutting off the TM region of Mmm1 with protease, it is expected that the solubility of the ERMES complex is increased, aggregation is suppressed, and将促进重建为纳米盘等。我们正在研究菌株VPS39Δ）]]。