Development of anti-scirrhous stomach cancer produced by the deep-sea actinomyces

深海放线菌抗硬胃癌的开发

基本信息

批准号：
21H03007
负责人：
坪内泰志
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka City University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和4年度では研究課題対象である抗スキルス胃癌活性を呈する深海・海洋性放線菌32株のうち3株に対して、活性物質の精製法確立および、生産菌ゲノム解析を行なった。評価した3株のうち、非タンパク質性の活性化合物を生産するものが1株、ペプチド性の活性化合物を生産するものが2株と見積もられた。非タンパク質性の活性候補分子は常法に従い、C18固相抽出、酢酸エチルを用いた液液分画、C18系Preparative HPLCシステムを用い、ほぼ単一ピークになるまで精製するに至った。ペプチド性の活性化合物は硫酸アンモニウム濃縮、親水性クロマトグラフィーの一種であるHILIC系Preparative HPLCシステムを用い、精製を進めた。活性評価には弊学附属病院で樹立した培養細胞（正常線維芽細胞及びスキルス胃癌細胞株7株のうち4株）を用い、精製各段階での活性の追跡、および比活性算出に用いた。同活性化合物群を対象とするOrbitrap-MSを用いた精密質量分析では、それらのm/zが300~800の範囲内に収まることから、分析対象とする4活性化合物は低中分子化合物であることが明らかとなった。生産菌ゲノム解析では、long read dataにはONT社MinIONシステム、short read dataにはIllumina社NovaSeq、ないしはMGI社　のDNBSEQ T7を遂行し、2プラットフォームを採用した。得られた各データからopen source codeによるバイオインフォマティクス手法でwhole genome配列を構築することに成功した。決定した6株分のゲノム配列はそのゲノムサイズが6Gb~11Gbと幅広く、コードされている16S rRNA遺伝子を指標とした分析からはいずれも新種株に相当することが見出された。解析したゲノム配列は公共データベースであるDDBJに登録申請済みである。

在2022年，我们建立了一种净化活性物质的方法，并分析了32个深海和海洋放线菌的基因组，该基因组表现出抗杀菌性胃癌活性，这是研究主题的主题。在评估的三种菌株中，一种菌株产生非蛋白质活性化合物，两种菌株产生了肽活性化合物。通过常规方法纯化非蛋白型活性候选分子，使用C18固相萃取，使用乙酸乙酯液 - 液体分级和基于C18的制剂HPLC系统纯化到近单个峰。使用硫酸铵浓度和基于HILIC的制剂HPLC系统（一种亲水性色谱法）纯化肽活性化合物。为了进行活性评估，使用了在附属医院建立的培养细胞（七个正常成纤维细胞和胃癌细胞系中的4个），并用于在纯化的每个阶段跟踪活动并计算特定活性。使用Orbitrap-MS对同一活性化合物组进行精确质谱法表明，这些化合物的M/Z属于300至800的范围，并且要分析的四种活性化合物是低中等分子化合物。在对生产细菌的基因组分析中，ONT的奴才系统使用两个平台用于长读数据，Illumina的Novaseq或MGI的DNBSEQ T7用于简短读取数据。从每个获得的数据中，我们使用开源代码成功地使用生物信息学方法成功构建了整个基因组序列。确定的六个菌株的基因组序列的基因组大小范围从6GB到11GB，并且使用编码的16S rRNA基因作为指标分析，发现所有菌株都与新物种相对应。分析的基因组序列已应用于公共数据库DDBJ的注册。