角膜実質細胞の分化における小胞体ストレス応答の働き

内质网应激反应在角膜细胞分化中的作用

• 批准号: 19K18879
• 负责人: 宮城 秀考
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K18879/
• 关键词: 角膜実質細胞; 線維化; 小胞体ストレス; 角膜線維芽細胞; PERK; 筋線維芽細胞; 創傷治癒

マウス胚線維芽細胞を2ng/ml TGF-βで刺激し筋線維芽細胞への分化を促すと、小胞体ストレスマーカーであるBiPやspliced XBP-1の遺伝子発現が誘導されることから、小胞体ストレスが起きていることが示唆された。また、小胞体ストレス応答経路の主要な３つのセンサータンパクであるPERK、IRE1、ATF6それぞれをノックアウト、またはノックダウンしたマウス胚線維芽細胞をTGF-βで刺激し、それぞれの筋線維芽細胞への分化をα-smooth muscle actinの遺伝子発現で評価すると、PERKをノックアウトしたマウス胚線維芽細胞においては発現が抑制された。以上のことから線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化には小胞体ストレス応答経路の内、主にPERK経路が関わっていることが示唆された。並行して、野生型マウスの角膜を採取し、disc上で培養することでマウスの角膜実質細胞を分離培養する手技を確立した。また、ヒト強角膜片から角膜実質を切り出し、dish上で培養することで角膜実質から線維芽細胞を初代培養することに成功した。初代培養したヒト角膜実質細胞を様々な条件の器質上で培養するため、ヒト角膜の硬さを模した25ｋPa（正常角膜）と75ｋPa（線維化した角膜）のハイドロゲルを作成する手技を確立した。また、細胞培養可能になるようハイドロゲルの細胞毒性を無くす最適な洗浄法を決定した。その後、新型コロナウイルス感染症流行のため研究は中断していた。この度、研究代表者の異動により研究継続ができなくなったため廃止申請を行った。

当用2 ng/ml TGF-β刺激小鼠胚胎成纤维细胞促进肌成纤维细胞分化时，内质网应激标记物BiP和剪接的XBP-1的基因表达被诱导，表明内质网应激正在发生。此外，用TGF-β刺激内质网应激反应途径的三种主要传感器蛋白PERK、IRE1和ATF6已被敲除或敲低的小鼠胚胎成纤维细胞，并观察对每个细胞的影响。用TGF-β刺激肌成纤维细胞，当通过α-平滑肌肌动蛋白的基因表达评估分化时，PERK被敲除的小鼠胚胎成纤维细胞的表达受到抑制。这些结果表明，在内质网应激反应通​​路中，PERK通路主要参与成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。与此同时，我们建立了一种通过收集野生型小鼠的角膜并将其培养在圆盘上来分离和培养小鼠角膜基质细胞的技术。我们还通过从一块人巩膜上切下角膜基质并将其培养在培养皿上，成功地对角膜基质中的成纤维细胞进行了原代培养。为了在各种条件下的组织上培养原代培养的人角膜基质细胞，我们建立了一种模拟人角膜硬度的水凝胶技术，其硬度为25 kPa（正常角膜）和75 kPa（纤维化角膜）。我们还确定了最佳的洗涤方法，以消除水凝胶的细胞毒性，使其可以进行培养。此后，由于新型冠状病毒感染的爆发，研究暂停。由于主要研究者发生变动，我无法继续研究，所以我申请废除。