ミトコンドリア膜間部タンパク質の外膜透過における分子機構の解明

阐明线粒体膜间蛋白渗透外膜的分子机制

基本信息

批准号：
20J00033
负责人：
阪上春花
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は膜間部タンパク質の外膜透過の分子機構の解明を目的とする。これまでの申請者の研究で、ミトコンドリアの膜間部タンパク質のインポート効率が呼吸条件依存的に促進することがわかっている。申請者はミトコンドリアの活性をより必要とする呼吸条件で、膜間部タンパク質のインポートを促進する未知の因子があると考え、当該年度は因子の同定を目指した。Twin CXXXCモチーフを有する膜間部タンパク質は、外膜のTOM複合体を透過した後、内膜のMia40によってシステインが酸化され、膜間部で成熟する。内膜のNアンカータンパク質であるMia40のC末端に、TurboIDを付加した融合タンパク質を発現する酵母株を作製し、Mia40周辺に近接するタンパク質の近接ビオチン化を試みた。ミトコンドリアの可溶化液には多種のビオチン化タンパク質が含まれていたため、可溶化液をグリセロールの密度勾配遠心を行い、Mia40と同じ画分に分画されるビオチン化タンパク質を濃縮した。ビオチン化タンパク質を質量解析した結果、ミトコンドリアの電子伝達に関与する因子が複数ヒットした。候補のうち、X遺伝子を欠損させた酵母株で、呼吸条件において膜間部タンパク質のインポート後のステップに影響がみられた。先行研究で、野生型酵母における因子Xの発現量は発酵条件と比較して、呼吸条件では約9倍上昇することがわかっている。以上のことから、因子Xは呼吸条件で発現量が増加することで、膜間部タンパク質の成熟化に寄与していると考えられる。今後は因子Xが膜間部タンパク質の成熟化のどのステップで関与しているか、分子メカニズムの詳細を明らかにする必要がある。

本研究的目的是阐明膜间蛋白渗透外膜的分子机制。申请人先前的研究表明，线粒体膜间蛋白的输入效率以依赖于呼吸状况的方式提高。申请人认为，在需要更多线粒体活性的呼吸条件下，存在一种未知因素可以促进膜间蛋白的输入，今年的目标是鉴定该因素。带有Twin CCXXC基序的膜间蛋白穿过外膜中的TOM复合体后，半胱氨酸被内膜中的Mia40氧化，它们在膜间区域成熟。我们创建了一种表达融合蛋白的酵母菌株，TurboID 连接到 Mia40（内膜的 N 锚定蛋白）的 C 末端，并尝试对 Mia40 附近的蛋白进行近端生物素化。由于线粒体裂解物含有多种生物素化蛋白质，因此对裂解物进行甘油密度梯度离心以浓缩与Mia40相同级分中分级的生物素化蛋白质。通过对生物素化蛋白质进行质谱分析，发现了多种参与线粒体电子传递的因素。在候选者中，删除X基因的酵母菌株对呼吸条件下导入膜间蛋白后的步骤有影响。先前的研究表明，野生型酵母中因子X的表达水平在呼吸条件下比在发酵条件下高约九倍。综上所述，认为因子X通过增加呼吸条件下的表达水平来促进膜间蛋白的成熟。未来有必要阐明因子X参与膜间蛋白成熟的分子机制的细节。