Elucidation of molecular feedback mechanisms underlying mechano-homeostasis governing 3D organ formation and regeneration

阐明控制 3D 器官形成和再生的机械稳态的分子反馈机制

• 批准号: 21H02683
• 负责人: 清木 誠
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02683/
• 关键词: YAP メカノホメオスターシス; 力学恒常性; 時空間的ダイナミクス制御; YAP; フィードバック; 立体臓器; 再生; 臓器形成

本年度は、研究の目的である臓器形成・再生過程でのYAP-MH時空間的ダイナミクス制御に関わる分子を明らかにするための解析を行った。(1)YAP活性化の時空間的パターンの変化を明らかにするために、YAP遺伝子の下流にRFPをCRISPR-Cas9法を用いてノックインしたトランスジェニックゼブラフィッシュを育成中である。これらから、適切な系統を樹立する予定である。(2)これまでに見いだした39のYAPの標的遺伝子の中から、YAP-MH時空間的ダイナミクス制御に関わる新規遺伝子の同定に成功した。候補遺伝子のshRNAを用いてノックダウンしたRPE-1細胞の免疫染色でYAP活性が亢進していた。本遺伝子の全長のcDNAをクローニングしGFPで標識して発現させると細胞膜近辺への局在が見られた。以前の核膜蛋白のBioID解析で同定された蛋白であるため、核膜での機能も持つ可能性がある。現在、YAPの一過性の活性化が重要な役割を果たすゼブラフィッシュヒレの再生過程での本遺伝子の機能解析を行うための準備を進めている。今後は、本遺伝子のYAP-MHの時空間的ダイナミクス制御の分子メカニズムを明らかにするために、BioIDを用いて結合分子を同定し核膜での機能を明らかにする。(3) 本遺伝子のgain-of-function及びloss-of-functionでのゼブラフィッシュヒレ再生系で、組織の力学特性がどのように変わるかを力学測定法により解析する予定である。

今年，我们进行了分析，以阐明在器官形成和再生过程中参与YAP-MH时空动力学控制的分子，这也是我们研究的目的。 (1)为了阐明YAP激活的时空模式的变化，我们目前正在利用CRISPR-Cas9方法培育YAP基因下游RFP被敲除的转基因斑马鱼。由此，我们计划建立合适的菌株。 (2)我们从目前发现的39个YAP靶基因中成功鉴定出一个参与YAP-MH时空动态控制的新基因。使用候选基因 shRNA 敲除的 RPE-1 细胞的免疫染色显示 YAP 活性增加。当克隆该基因的全长cDNA、用GFP标记并表达时，观察到细胞膜附近的定位。由于该蛋白先前是通过核膜蛋白的 BioID 分析鉴定的，因此它也可能在核膜中具有功能。我们目前正准备分析该基因在斑马鱼鳍再生过程中的功能，其中YAP的瞬时激活发挥着重要作用。未来，我们将利用BioID鉴定结合分子并阐明其在核膜中的功能，以阐明该基因控制YAP-MH时空动态的分子机制。 (3)我们计划利用机械测量方法利用该基因的功能获得和功能丧失来分析斑马鱼鳍再生系统中组织的机械特性如何变化。