核磁気共鳴法を用いたGタンパク質共役型受容体によるシグナル制御機構の解明

利用核磁共振阐明 G 蛋白偶联受体的信号控制机制

基本信息

批准号：
21H02410
负责人：
幸福裕
金额：
$ 10.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

1.ケモカイン受容体のNMR解析条件の確立GPCRの一種であるケモカイン受容体における、Gタンパク質経路とアレスチン経路の活性化機構を解明するため、ケモカイン受容体のNMR解析を進めた。まず、メチオニンメチル基を選択的に標識したケモカイン受容体を調製し、NMRスペクトルを測定した。しかしながら、内在性のメチオニン残基のシグナルでは、リガンドによる変化が小さく、詳細な解析が困難であることがわかった。そこで、ケモカイン受容体の膜貫通領域の様々な部位に、変異によりメチオニン残基を導入し、NMR解析をおこなった。その結果、阻害剤と作動薬で化学シフトが異なるメチオニンプローブを複数見出すことに成功した。これにより、ケモカイン受容体のどの領域が構造変化することで、活性化が起こるのかを解明するための、NMR解析条件が確立できた。2.β2ARの構造モチーフの解析GPCRのGタンパク質経路とアレスチン経路の活性化機構の解明において、GPCRに共通するメカニズムはこれまで明らかになっておらず、その解明が望まれている。そこで、構造生物学的解析が進んでいるGPCRであるβ2アドレナリン受容体（β2AR）のNMR解析もあわせて進めることとした。β2ARには、安定同位体標識試料が多く得られるという利点がある。そこで、他のGPCRでは測定感度の観点から利用が困難な主鎖アミドプローブの観測を含めて、様々な標識法を検討した。その結果、GPCRに共通する構造モチーフ（PIF, DRY, NPxxY）について、それぞれのモチーフの構造変化を反映すると考えられる、NMRプローブを見出すことができた。本結果により、β2ARの各シグナル伝達経路の活性化メカニズムを、モチーフの構造変化の観点から解析するための基盤が確立できた。

1.趋化因子受体NMR分析条件的建立为了阐明作为GPCR的一种的趋化因子受体中G蛋白途径和抑制蛋白途径的激活机制，我们对趋化因子受体进行了NMR分析。首先，我们制备了选择性地标记有甲硫氨酸甲基的趋化因子受体并测量了其NMR谱。然而，发现内源性蛋氨酸残基的信号由于配体而几乎没有变化，使得详细分析变得困难。因此，我们通过突变将蛋氨酸残基引入趋化因子受体跨膜区的各个位点并进行NMR分析。结果，他们成功地发现了多种具有不同化学位移的抑制剂和激动剂蛋氨酸探针。因此，我们能够建立核磁共振分析条件，以阐明趋化因子受体的哪个区域经历了导致激活的结构变化。 2.β2AR的结构基序分析在阐明GPCRs的G蛋白途径和抑制蛋白途径的激活机制中，迄今为止GPCRs共有的机制尚未阐明，需要对其进行阐明。因此，我们决定对β2肾上腺素受体（β2AR）进行NMR分析，β2肾上腺素受体是一种GPCR，其结构生物学分析已经取得进展。 β2AR的优点是可以获得许多稳定同位素标记的样品。因此，我们研究了各种标记方法，包括观察主链酰胺探针，由于测量灵敏度，这些方法很难与其他 GPCR 一起使用。结果，我们能够找到被认为反映 GPCR 常见结构基序（PIF、DRY、NPxxY）结构变化的 NMR 探针。这些结果为从基序结构变化的角度分析各β2AR信号转导通路的激活机制奠定了基础。