診断情報最大化を指向したヒト唾液エクソソームの密度と形態によるサブタイプ分け

通过密度和形态对人类唾液外泌体进行亚型分类，以最大限度地提高诊断信息

• 批准号: 19K18969
• 负责人: 山本 恵史
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tokyo Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K18969/
• 关键词: exosome; small EV; 唾液; 透過型電子顕微鏡; 超音波; 前処理; エクソソーム; プロテオミクス; リキッドバイオプシー; 液体生検; 診断

当該年度では昨年度までで明らかとなった全唾液からexosomeを密度勾配遠心にて精製し、唾液の前処理としての超音波処理のexosomeへの影響についての検討であるが、exosomeは前処理の超音波では小胞の膜を破壊されるようなことはなく、むしろ高粘性をもつ唾液からの精製においては非常に有効な方法であることがわかった。そこで本年度は透過型電子顕微鏡にて唾液exosomeの大きさを解析、また一次抗体によって修飾されたゴールドのコロイド粒子用いて免疫染色することによって、唾液exosomeに発現するタンパク質と、その粒子の大きさによって、2019年度に明らかにした密度とタンパク質によるサブクラス化の情報をより豊かに明らかにする研究を進めた。まずは未だ多くの実験者が行っていないポジティブ染色による透過型電子顕微鏡の唾液エクソソーム解析をおこなうため、ポジティブ染色法の条件検討から行なった。密度勾配遠心で精製した唾液exosomeの沈殿物は非常に小さいので、先にパラホルムアルデヒドの固定液で固定させてからレジンへ包埋し、薄切、染色、観察すると、ポジティブ染色によって唾液exosomeらしき小胞を観察することに成功した。次に免疫染色に発展させるために条件検討をおこなった。包埋、薄切後に、抗原性を高めるために酸処理しCD81抗体修飾金コロイド粒子にて免疫染色を行なったところ、金粒子が小胞膜表面にいくつか結合する唾液exosomeをいくつか捉えることができた。しかしながら唾液exosomeのサイズが予想よりも小さく、金粒子の大きさで小胞が覆われるケースが多かった。また粒子を小さくすると同じ条件で観察できなくなることも予想されるので、今後はより小さい金粒子のサイズでの実験手技の検討が望まれる。

在今年，外泌体通过密度梯度离心从所有唾液中纯化，直到去年，这是据透露的，并研究了超声处理作为唾液预处理对外泌体的影响。但是，发现外泌体是高粘度净化唾液的最有效方法。因此，今年，我们使用透射电子显微镜分析了唾液外泌体的大小，并使用原代抗体修饰的金胶体颗粒进行了免疫染色，以进一步阐明2019年揭示的密度和蛋白质亚分类信息，该信息基于唾液外壳和颗粒大小的蛋白质。首先，我们研究了阳性染色方法的条件，以便使用阳性染色使用透射电子显微镜进行唾液外泌体分析，许多实验者尚未进行。通过密度梯度离心纯化的唾液外泌体的沉淀非常小，因此首先用多聚甲醛固定剂固定产物，然后嵌入树脂中，经过薄薄的切片和染色和观察，它成功地观察了囊泡，这些囊泡似乎是唾液exosomes，阳性呈阳性。接下来，检查条件以发展免疫染色。嵌入和切片后，用酸处理的CD81抗体修饰的金胶体颗粒进行免疫染色，以增加抗原性，并进行一些唾液外泌体，其中黄金颗粒与囊泡膜的表面结合。但是，唾液外泌体的大小比预期的要小，在许多情况下，囊泡被金颗粒的大小覆盖。此外，预计如果颗粒很小，则不可能在相同的条件下观察它们，因此希望将来考虑具有较小金颗粒的实验技术。

项目成果

全唾液から遠心法を用いて分離した唾液exosomeのポジティブ染色による透過型電子顕微鏡観察

使用离心从全唾液中分离出的唾液外泌体的阳性染色进行透射电子显微镜观察

• 发表时间: 2019
• 作者: 山本恵史;芝清隆;橋本貞充;笠原正貴
• 通讯作者: 笠原正貴

口腔液から差別遠心法を用いて分離した微粒子のポジティブ染色による透過型電子顕微鏡観察

使用差速离心从口腔液中分离出的微粒的阳性染色进行透射电子显微镜观察

• 发表时间: 2019
• 作者: 山本恵史;橋本貞充;笠原正貴;芝清隆
• 通讯作者: 芝清隆