Does GPI-anchored modification promote the pathogenicity and transmissibility of alpha-synucleinopathies?

GPI 锚定修饰是否会促进 α-突触核蛋白病的致病性和传播性？

基本信息

批准号：
20K21579
负责人：
新竜一郎
金额：
$ 4.08万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

プリオン病以外のタンパク質異常凝集性神経変性疾患（アルツハイマー病、レビー小体病、タウオパチー等）の伝達性や病原性はプリオン病と比較すると相対的に低く、そのメカニズムに質的な違いがあることが想定される。その要因としてプリオンタンパク質（PrP）のC末端に翻訳後修飾として付加されるGPIアンカーの存在が考えられる。本研究ではレビー小体病の病原タンパク質アルファシヌクレイン（Asyn）にGPIアンカーを付加して発現するように遺伝子操作し、その凝集様式・疾患伝達性と神経変性のメカニズムを解明することを目的としている。まず、GPIアンカー付加シグナルペプチドをAsynのN末とC末に導入し、それぞれのタンパク質へのGPIアンカー修飾型を構築した。GPIアンカー付加シグナルペプチドとしてはPrPのものを使用した。構築した発現ベクターを培養細胞（N2a）に一過性に導入し、Asynの発現をウェスタンブロットにより確認したところ、GPIアンカーが導入されたことを反映し、GPIアンカーのない通常のAsynより分子量は上昇していた。次に、恒常的発現細胞を得るため、トランスポゾンのPiggyBac systemを用いて薬剤セレクションを行ったが、高発現細胞を得ることはできなかった。しかし、遺伝子レベルの導入はPCRで確認していたため、プロテアソーム抑制剤を投与したところ、発現の上昇を認めたことから、GPI（＋）Asynがプロテアソームでの分解が上昇している可能性が示された。一方、N2a細胞にAsynを恒常的に発現する細胞を得ることができたため、それらにレビー小体病や多系統萎縮症の脳ホモジネートを添加してプリオンのようなＡｓｙｎ凝集体の”感染“細胞が得られるかどうか現在検証している。

朊病毒病以外的蛋白质异常聚集性神经退行性疾病（阿尔茨海默氏病、路易体病、tau蛋白病等）的传染性和致病性与朊病毒病相比相对较低，并且推测其机制存在质的差异。其原因被认为是作为翻译后修饰添加到朊病毒蛋白 (PrP) C 末端的 GPI 锚的存在。在这项研究中，我们对α-突触核蛋白（Asyn）（一种导致路易体病的蛋白质）进行了基因改造，使其带有 GPI 锚定蛋白，旨在阐明其聚集模式、疾病传播和神经变性机制。首先，将 GPI 锚定的信号肽引入 Asyn 的 N 端和 C 端，以构建每种蛋白的 GPI 锚定的修饰版本。 PrP 用作 GPI 锚添加信号肽。当将构建的表达载体瞬时导入培养细胞（N2a）并通过Western blotting确认Asyn表达时，分子量比没有GPI锚定的正常Asyn低，反映出GPI锚定的引入正在上升。接下来，为了获得组成型表达细胞，使用转座子PiggyBac系统进行药物筛选，但无法获得高表达细胞。然而，由于已通过PCR确认了基因水平的导入，因此当施用蛋白酶体抑制剂时，观察到表达增加，这表明GPI(+)Asyn可能被蛋白酶体降解。另一方面，由于我们能够获得组成型表达Asyn的N2a细胞，因此我们向这些N2a细胞中添加了路易体病和多系统萎缩的脑匀浆，并用朊病毒样Asyn聚集体感染了细胞，目前我们正在验证是否存在这种情况。这是可能的。