レクチン（糖認識ドメイン）表層発現酵母創製技術の確立とバイオ分析技術への新展開

建立在表面表达凝集素（糖识别结构域）的酵母创造技术以及生物分析技术的新进展

• 批准号: 22K05162
• 负责人: 高山 勝己
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukui National College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05162/
• 关键词: 酵母細胞表層工学; マンノース糖鎖認識レクチン; GPIアンカー; 糖鎖認識レクチン; アフィニテイークロマトグラフィー担体; レクチンアレイ分析

本年度の計画は，細胞表層工学技術を用いて酵母Saccharomyces cerevisiae MT8-1株の細胞表層にマンノース結合レクチン（MBL）の糖認識ドメイン（CRD）を発現させるためのプラスミドを構築（pMW MBL/CRD）し，最適な表層発現条件を確立した後、発現の確認を抗体染色による直接蛍光顕微鏡観察により行う事を目的とした．初年度１年間に実施された研究の具体的流れを以下に示す。1）ヒトMBL/CRD（エクソン4領域）遺伝子配列情報をDDBJデータベースから入手し、業者委託によりMBL/CRD遺伝子インサートを合成した。2）酵母表層発現用ベクター（GPIアンカーを介して、酵母細胞表層に任意のタンパク質をN-末を介して発現するためのカセットシャトルベクター：pMWFD）に、MBL/CRD遺伝子配列を持つDNAインサートを、TAKARA社のインフュージョン法を用いて、組込みpMW MBL/CRDプラスミドを構築した。3）大腸菌（DH５α株）にpMW MBL/CRDを形質転換した後、表層発現ベクターの必要量を確保し、続いて酵母MT8-1株に形質転換した。4）pMW MBL/CRD遺伝子配列のシークエンスを業者委託により行い、pMW MBL/CRDが意図した位置に挿入され、配列が設計通りであるか（変異が起こっていないこと）確認を行った。5）酵母用選択培地を用いて（25℃、pH7）で、定常状態まで培養し、酵母細胞を遠心分離により回収した。6）MBL/CRDタンパクが酵母表層に発現されているか確認するために、MBL/CRD配列末端に付加したFLAGタグに、抗FLAG抗体染色を行ってから、蛍光顕微鏡観察を行った。しかしながら、一部の酵母に対して、表層発現が確認されたが殆どの酵母は発現がみられなかった。

今年的计划是利用细胞表面工程技术构建质粒（pMW MBL/CRD），在酿酒酵母菌株MT8-1的细胞表面表达甘露糖结合凝集素（MBL）的糖识别结构域（CRD）。建立最佳表面表达条件后，我们旨在使用抗体染色通过直接荧光显微镜确认表达。第一年的研究具体流程如下所示。 1）从DDBJ数据库获取人MBL/CRD（外显子4区域）基因序列信息，并由承包商合成MBL/CRD基因插入片段。 2) 将带有 MBL/CRD 基因序列的 DNA 插入片段插入酵母表面表达载体（用于通过 GPI 锚定在酵母细胞表面上的 N 末端表达任何蛋白质的盒式穿梭载体：pMWFD 集成的 pMW MBL/）。使用TAKARA的输注方法构建CRD质粒。 3)用pMW MBL/CRD转化大肠杆菌(DH5α菌株)后，确保必要量的表面表达载体，然后转化酵母菌株MT8-1。 4) 将pMW MBL/CRD基因序列外包给供应商，以确认pMW MBL/CRD插入到预期位置并且序列符合设计（没有发生突变）。 5)使用酵母选择性培养基(25℃，pH 7)，将酵母细胞培养至稳定状态并通过离心收集。 6)为了确认MBL/CRD蛋白是否在酵母表面表达，用抗FLAG抗体对附着在MBL/CRD序列末端的FLAG标签进行染色，然后使用荧光显微镜观察。然而，尽管在一些酵母中确认了表面表达，但在大多数酵母中没有观察到表达。