復帰変異モザイクモデルマウスを用いた表皮細胞の増殖優位性獲得機序の解明

使用逆转镶嵌模型小鼠阐明表皮细胞获得增殖优势的机制

• 批准号: 21H02943
• 负责人: 新熊 悟
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02943/
• 关键词: 表皮水疱症; 復帰変異モザイク; 細胞競合; 相同組換え

本研究では、表皮細胞の増殖優位性を獲得する機序を解明するため、遺伝子編集技術を応用した復帰変異モザイクを有する表皮水疱症モデルマウスを世界で初めて作製し、①増殖優位性を有する表皮幹細胞の同定や②上皮-間葉転換の役割を明らかにする。復帰変異モザイクは体細胞分裂時の相同組換えによって生じるため、複合ヘテロ接合型遺伝子変異を有するマウスを作製する必要がある。Col17遺伝子のexon2とexon3にフレームシフト変異を導入したマウスをそれぞれ作製し、これらのマウスを交配することで、それぞれのアリルのexon2とexon3にフレームシフト変異を有する複合ヘテロCol17欠損マウスの作製に成功した。複合ヘテロCol17欠損マウスの培養表皮細胞に対して、CRISPR/Cas9発現AAVベクターを用いてexon2とexon3の間で遺伝子切断したところ、一部の細胞でCol17発現量の増加が確認でき、復帰変異モザイクを誘導できた。さらにCol17を発現する表皮角化細胞を抽出し、次世代シーケンス（Pacbio）を行ったところ、一部の細胞において相同組換えが生じていることが同定できた。また、このAAVベクターを複合ヘテロCol17欠損マウスに遺伝子導入し、生体内で復帰変異モザイクを誘導させ、復帰変異モザイクの有無について免疫組織学的解析を用いて解析をおこなったところ、一部において、復帰変異モザイクが生体内で生じていることが証明できた。

在这项研究中，为了阐明表皮细胞获得增殖优势的机制，我们利用基因编辑技术创建了世界上第一个具有逆转镶嵌的大疱性表皮松解症模型小鼠，并（2）阐明了上皮细胞的作用。间质转化。由于体细胞分裂过程中通过同源重组发生回复镶嵌现象，因此有必要产生具有复合杂合基因突变的小鼠。通过创建在 Col17 基因的外显子 2 和外显子 3 中引入移码突变的小鼠并与这些小鼠杂交，我们成功地创建了每个等位基因的外显子 2 和外显子 3 中具有移码突变的复合杂合 Col17 缺陷小鼠。当我们使用表达 CRISPR/Cas9 的 AAV 载体在复合杂合 Col17 缺陷小鼠的培养表皮细胞中切割外显子 2 和外显子 3 之间的基因时，在一些细胞中证实了 Col17 表达的增加，这表明我能够逆转马赛克。诱发此外，当我们提取表达Col17的表皮角质形成细胞并进行下一代测序（Pacbio）时，我们能够鉴定出某些细胞中发生了同源重组。此外，我们将该AAV载体转染到复合杂合Col17缺陷小鼠中以在体内诱导逆转嵌合体，并使用免疫组织学分析分析逆转嵌合体的存在或不存在，我们能够证明体内存在逆转嵌合体。

项目成果

Current topics in Epidermolysis bullosa: Pathophysiology and therapeutic challenges.

• DOI: 10.1016/j.jdermsci.2021.11.004
• 发表时间: 2021-12
• 期刊: Journal of dermatological science
• 影响因子: 4.6
• 作者: K. Natsuga;S. Shinkuma;C. Hsu;Y. Fujita;A. Ishiko;K. Tamai;J. McGrath

CRISPR/Cas9 targeting an intronic region for retrieving Col17 expression in junctional epidermolysis bullosa model mice

CRISPR/Cas9靶向内含子区域以恢复交界性大疱性表皮松解症模型小鼠中Col17的表达

• 发表时间: 2021
• 作者: Nakamura Shunta;Nakamura Kiminori;Yokoi Yuki;Shimizu Yu;Ohira Shuya;Hagiwara Mizu;Song Zihao;Gan Li;Aizawa Tomoyasu;Hashimoto Daigo;Teshima Takanori;Ouellette Andre J.;Ayabe Tokiyoshi;Hong Ha Nguyen
• 通讯作者: Hong Ha Nguyen

New insight of itch mediators and proinflammatory cytokines in epidermolysis bullosa

大疱性表皮松解症中瘙痒介质和促炎细胞因子的新见解

• DOI: 10.1002/cia2.12230
• 发表时间: 2022
• 期刊: Journal of Cutaneous Immunology and Allergy
• 影响因子: 1
• 作者: Nguyen Hong Ha;Shinkuma Satoru;Hayashi Ryota;Katsumi Tatsuya;Nishiguchi Tomoki;Natsuga Ken;Fujita Yasuyuki;Abe Riichiro
• 通讯作者: Abe Riichiro

モザイク病変と遺伝性皮膚疾患

马赛克病变和遗传性皮肤病

• 发表时间: 2021
• 作者: Dertschnig Simone;Gergely Peter;Finke Jurgen;Schanz Urs;Holler Ernst;Holtick Udo;Socie Gerard;Medinger Michael;Passweg Jakob;Teshima Takanori;Stylianou Christos;Oehen Stephan;Heim Dominik;Bucher Christoph;Akiyama M.;新熊 悟
• 通讯作者: 新熊 悟