電位依存性イオンチャネルの機能構造と構造間遷移機構の解析による動作機構解明

通过分析功能结构和结构到结构的转变机制阐明电压门控离子通道的运行机制

基本信息

批准号：
21H02618
负责人：
大澤匡範
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

電位依存性イオンチャネル(VGIC)は、膜電位に応じた特定イオンの膜透過を通じて膜電位を制御し、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGICは一般に、膜電位依存的に静止構造・透過性構造・不透過性構造の間を遷移することによりゲートを開閉し、特定のイオンを膜透過させることで膜電位を制御する。しかしながら、これまでに複数の機能構造が原子分解能で明らかになったVGICはなく、膜電位のかかった静止構造や一過的にしか存在しない構造、および、機能構造間の遷移メカニズムは未解明である。そこで本研究では、化学修飾により未解明である機能構造を安定化する手法を確立し、それぞれの構造の意味を電気生理学的解析により解明するとともに、それらの立体構造をX線結晶構造解析あるいはクライオ電子顕微鏡により原子レベルで明らかにする。同時にNMRによりそれらの間の構造遷移を解析することにより、VGICの動作メカニズムを解明することを目的とする。本研究では、膜電位依存的に形成される電位依存性K+チャネルKvAPの各機能構造を安定化するために、電位センサードメイン内の2か所にCys変異を導入し両者をSS結合で固定化する。これまでに25種類のダブルCys変異体を調製し、SS結合形成能を評価したところ、5変異体において膜電位非存在下であってもSS結合が形成されることを見出した。これらの変異体に導入した2残基のCysは、すでに報告されているKvAPの電顕構造ではSS結合が形成できない距離にあるものが4個含まれていた。このことから、電位センサーの異なるコンホメーションがSS結合により安定化されたことが示唆された。そこで、これらの5変異体がどのような機能状態を反映した構造であるか、電気生理学的に調べるとともに、試料の大量調製法を確立し、電顕での予備実験を行った。

依赖电压的离子通道（VGIC）是膜蛋白，可通过根据膜电位对特定离子渗透来控制膜电位，并且负责神经传递和心跳，并且也很重要，作为药物发现的靶标。 VGIC通常通过以膜电位依赖性方式在固定结构，可渗透结构和不可渗透结构之间过渡，并通过渗透特定离子来控制膜电位，从而打开和关闭门。但是，没有VGIC在原子分辨率下揭示了多个功能结构，并且具有仅瞬时存在的膜电位和结构的固定结构，并且尚未阐明功能结构之间的过渡机制。因此，在这项研究中，我们建立了一种稳定尚未通过化学修饰阐明的功能结构的方法，并且通过电生理学分析阐明了每个结构的含义，并使用X射线晶体结构分析或冷冻电子显微镜在原子水平上阐明了三维结构。目的是通过同时分析NMR之间的结构过渡来阐明VGIC的运行机理。在这项研究中，为了稳定电压依赖性的K+通道KVAP的每个功能结构，以膜电位依赖性方式形成，将Cys突变引入了电势传感器域内的两个位置，并且两者都被SS结合固定。到目前为止，已经制备了25种不同的双CYS突变体，并且它们的形成SS结合的能力，并且发现即使在没有膜电位的情况下，也可以在五个突变体中形成SS结合。引入这些突变体的两个残基Cys包含先前报道的KVAP电子微结构中的四个无法形成SS键。这表明潜在传感器的不同构象通过SS键稳定。因此，我们在电生理学上研究了这五个突变体的功能状态，并建立了一种准备大量样品的方法，并使用电子显微镜进行了初步实验。