ヒト多能性幹細胞に由来する心臓オルガノイド作製のための基盤技術開発

开发人类多能干细胞来源的心脏类器官生产基础技术

基本信息

批准号：
20K12623
负责人：
白吉安昭
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

心臓オルガノイドは、1)素材細胞の再組立、2)in vitroで1次心臓領域（FHF）と2次心臓領域（SHF）に存在する心臓前駆細胞からの発生によって作ることができる。そこで、本研究では、4種の主要なサブタイプ心筋（心房筋、心室筋、洞結節ペースメーカ細胞、刺激伝導系細胞）と、2種類の心臓前駆細胞を、ヒトiPS細胞から作製することを目標としている。まず、ヒトiPS細胞に由来する各種サブタイプ心筋を分取し、電気生理学的特性などを解析した。その結果、HCN4/Shox2共陽性細胞として、70~80％の割合で洞結節ペースメーカ様細胞（以下、ペースメーカ細胞）を選択的に分取することに成功した。残り細胞は、心房筋あるいは心室筋様の活動電位を示した（Wakimizu et al. 2022）。そこで、ペースメーカ細胞の識別法を検討したところ、AIによる画像解析法によって、ペースメーカ細胞が他の心筋細胞から区別できることを明らかにすることができた。MLc2a/Mlc2vの共陽性細胞として、心房筋様細胞が優位に濃縮されるが、この心房筋様細胞を用いて、心房細動に関連するPPRX1転写因子が、Kv1.5などのイオンチャネルの発現制御に関わっていることを明らかにした。一方、HCN4-EGFP陽性細胞としてはFHF、Islet1-mCherry陽性細胞としてSHFの前駆細胞を分取できる。本年度は、さらに解析を進め、mCherry陽性細胞がまず出現してくること、分化誘導後3週間くらいでEGFPとmCherry陽性細胞は、相互に排他的に発現するようになり、それぞれFHFとSHF前駆細胞マーカーを発現することを明らかにすることができた。なお、これらの組み合わせによるオルガノイド形成については、顕著な進展が見られなかった。

心脏类器官可以通过 1) 原材料细胞的重新组装和 2) 从存在于体外初级心脏区域 (FHF) 和次级心脏区域 (SHF) 的心脏祖细胞发育来生成。因此，在这项研究中，我们的目标是从人类 iPS 细胞中产生四种主要的心肌亚型（心房心肌、心室心肌、窦房结起搏细胞和脉冲传导系统细胞）和两种类型的心脏祖细胞。首先，分离了源自人类 iPS 细胞的各种亚型心肌并分析了它们的电生理特性。结果，我们成功地以70-80%的比例将窦房结起搏器样细胞（以下简称起搏器细胞）选择性分选为HCN4/Shox2共阳性细胞。其余细胞表现出与心房心肌或心室心肌相似的动作电位（Wakimizu et al. 2022）。因此，我们研究了识别起搏细胞的方法，并能够证明使用基于人工智能的图像分析方法可以将起搏细胞与其他心肌细胞区分开来。心房肌样细胞主要富集为 MLc2a/Mlc2v 共阳性细胞，利用这些心房肌样细胞，我们可以表达与心房颤动相关的 PPRX1 转录因子，并且 Kv1.5 等离子通道的表达表明它参与其中。处于控制之中。另一方面，FHF前体细胞可以作为HCN4-EGFP阳性细胞分离，SHF前体细胞可以作为Islet1-mCherry阳性细胞分离。今年我们进行了进一步分析，发现首先出现mCherry阳性细胞，在分化诱导后约3周左右，EGFP和mCherry阳性细胞开始相互排斥表达，并分别形成FHF和SHF祖细胞我们能够证明该标记已表达。请注意，使用这些组合在类器官形成方面没有观察到显着进展。