RNAポリメラーゼIIのDNA二本鎖切断修復機構への関与の解明

阐明RNA聚合酶II参与DNA双链断裂修复机制

• 批准号: 20K19968
• 负责人: 磯野 真由
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K19968/
• 关键词: RNAポリメラーゼⅡ; DNA二本鎖切断修復; ユビキチン化; RNAポリメラーゼ; DNA二本鎖切断; 転写; DNA修復

DNA修復機構やDNA損傷応答の異常はゲノム不安定化に起因する。これまでに、真核生物における転写領域でのRNAポリメラーゼII（Pol II）の停滞はゲノム不安定性に関与することが報告されている。また、Pol IIが内因性のDNA二本鎖切断（DSB）の誘発に関与することも報告されている。しかし、転写領域でのPol IIとDSB修復との関係性について、詳細は明らかになっていない。本研究では、転写領域のDSB修復に対するPol IIの関与について明らかにすることを目的とした。まず、DSB修復関連タンパク質とPol IIとの相互作用について検討を行った。カンプトテシン（CPT）処理後の細胞を用いて、Pol II抗体による免疫沈降（IP）を行い、DSB修復関連タンパク質抗体の検出を試みた。その結果、幾つかのDSB修復関連タンパク質がPol IIと相互作用することを確認した。また、既報の転写共役型修復時に見られるPol IIのユビキチン化が、今回の状況でも生じるのか、上記IPを行い、Pol IIのバンドシフトを指標に検討した。CPT処理によって、Pol IIのバンドシフトが検出された。また、ユビキチン抗体を検出する実験からも、損傷依存的にPol IIのユビキチン化が起こることを明らかにした。さらに、相互作用に関与するユビキチンリガーゼの同定を試みた。ユビキチンリガーゼの発現抑制または欠損細胞を作成し、上記のIPを行った。その結果、あるユビキチンリガーゼの発現抑制または欠損により、Pol IIのユビキチン化の抑制、並びにPol IIとDSB修復関連タンパク質との相互作用の低下を確認した。以上の結果から、転写領域におけるDSB修復にはPol IIが関与しており、Pol IIのユビキチン化を介してDSB修復タンパク質が動員されることを示唆した。（未発表の為、タンパク質名は伏せた。）

DNA恢复机理和DNA损伤反应的异常是由于基因组不稳定引起的。迄今为止，据报道，真核生物的转录区域中RNA Polimerase II（POL II）的停滞与基因组不稳定性有关。还据报道，Pol II参与了内源性DNA BI链链切割（DSB）的诱导。但是，尚未披露在转录区域中Pol II与DSB修复之间的关系。在这项研究中，目的是阐明POL II在转录区域中进行DSB修复的参与。首先，我们检查了DSB修复相关蛋白与POL II之间的相互作用。在加工Kamutteshin（CPT）加工后，使用细胞进行了带有POL II抗体的免疫沉积（IP），并尝试尝试检测与DSB修复相关的蛋白质抗体。结果，已经证实了几种DSB修复相关蛋白与POL II相互作用。此外，在这种情况下还引起了POL II的IP，该IP在恢复中介转录的恢复中也是如此，并且IP是作为POL II的频带移位的指标。通过CPT处理检测到Pol II带移位。检测到泛素抗体的实验表明，pol II泛素是由于损伤而发生的。此外，我们尝试识别与相互作用有关的泛素连接酶。创建了泛素连接酶表达的表达或创建了不足的细胞，并进行了上述IP。结果，某个泛素连接酶的抑制或缺陷已经证实了pol II泛素之间相互作用的减少，以及POL II和DSB Repaien相关蛋白质之间相互作用的减少。从上述结果中，POL II参与了转录区域的DSB修复，这表明DSB修复蛋白通过pol II泛素化动员。 （蛋白质名称被隐藏为未发表。）